第一部分肝癌癌蛋白p28^GANK正反馈调节β-catenin信号通路的作用和机制研究研究背景肝细胞性肝癌（简称肝癌,Hepatocellular Carcinoma,HCC）是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。目前,尽管已经鉴定了一些肝癌相关的抑癌基因,如p53和p16^INK4a,并明确了它们在肝癌中的特异性失活,但是在肝癌发生中特异性激活的癌基因却少见报道。2000年日本科学家Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞癌组织高表达的基因中筛选出一条编码重复ankyrin（ANK）序列的新基因,命名为gankyrin。我们检索基因库后发现gankyrin基因与1998年Hori等人发现的p28（Nas6p）基因序列完全一致,遂将其命名为p28^GANK。癌基因p28^GANK编码的蛋白是人26S蛋白酶体（26S proteasome）调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基,其核酸序列中含有5个串联排列的ANK重复单位,其保守的ankyrin序列介导蛋白与蛋白间的相互作用。26S蛋白酶体中的20S蛋白小体是降解体内某些错误折叠蛋白或细胞周期蛋白的场所,目前尚不清楚癌蛋白p28^GANK在26S蛋白酶体降解蛋白过程中的具体分子作用机制。前期研究发现癌蛋白p28^GANK参与CDK4/CyclinD1/p16^INK4a/Rb1/E2F-1信号传导通路的调节,此通路的失调控在肝癌的发生发展过程中具有相当重要的作用;外源性转入癌基因p28^GANK使其高表达后的NIH/3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤。Nagao等人通过酵母双杂交发现黑色素瘤抗原MAGE-A4能与癌蛋白p28^GANK特异性的结合并抑制p28^GANK成瘤活性。β-连环蛋白（β-catenin）是一种重要的肿瘤相关基因,除了在细胞粘附中有重要作用外,还是Wnt信号通路的重要功能分子。通过在不同时间、空间上的差异表达调节一系列下游基因c-myc和cyclin-d1等的表达水平,参与细胞增殖、凋亡以及器官发育。近来研究发现,β-catenin在肝癌发生早期呈现异常聚集,并能够促进肝癌的发生以及早期肝癌细胞的快速生长。因此探讨β-catenin在肝癌发生发展中的作用具有重要价值。已有研究表明提高野生型p53水平可以明显下调β-catenin蛋白水平。结合新近研究发现p28^GANK能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用,介导野生型p53蛋白的泛素化及降解,提示在肝细胞癌的发生发展中可能存在着癌蛋白p28^GANK与β-catenin的相互联系。因此我们探讨了Wnt/β-catenin信号通路激活对p28^GANK表达的影响以及p28^GANK对β-catenin信号通路的调节作用。实验方法:1.采用Genomatix在线分析软件分析p28^GANK启动子区并构建p28^GANK报告基因质粒;2.运用双荧光素酶报告基因系统检测生长因子刺激对p28^GANK转录活性的影响;采用瞬时转染方法观察Ras对p28^GANK转录活性的影响;应用报告基因系统结合ERK与PI3K信号通路抑制剂确定生长因子与Ras对p28^GANK表达的调节通路;采用瞬时转染β-catenin和c-Myc表达质粒确定它们对p28^GANK表达的影响;3.通过Luciferase报告基因质粒pGL-OT（含有β-catenin/TCF4复合物特异结合区）与不同剂量p28^GANK质粒细胞共转染实验,确定p28^GANK对β-catenin/TCF4转录活性的影响;4.运用western blot及核浆分离技术,检测HEK293细胞瞬转p28^GANK后,β-catenin在胞核胞浆中的分布变化;5.运用western blot和转染技术研究生长因子、Ras、AKT、β-catenin、c-Myc对p28^GANK蛋白表达调节作用;应用RT-PCR技术研究生长因子、Ras、AKT、β-catenin、c-Myc等对p28^GANK表达的调节作用;6.运用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术研究β-catenin和c-Myc与28^GANK启动子区相互作用关系;7.应用腺病毒介导的RNA干扰技术下调表达肝癌细胞系中p28^GANK的水平,探讨其对β-catenin转录活性的作用,并进一步研究了p28^GANK对自身转录水平的影响。8.应用临床肝癌组织标本应用western blot和免疫组织化学方法检测β-catenin、c-Myc、cyclinD1表达水平与p28^GANK蛋白表达水平之间的关系。结果:1.肝细胞生长因子和表皮生长因子刺激明显上调饥饿处理后的HEK293和HepG2细胞中p28^GANK表达水平;瞬时转染Ras表达质粒显著上调p28^GANKmRNA和蛋白水平;2.PI3K抑制剂处理显著抑制细胞本底水平p28^GANK的表达,也能够阻断生长因子或Ras激活对p28^GANK表达的上调作用;瞬时转染PI3Kp85质粒和野生或持续激活的AKT表达质粒均能够上调p28^GANK的表达水平;3.报告基因、RT-PCR或western blot实验证明瞬时转染表达β-catenin和c-Myc都能够在转录和蛋白水平上调p28^GANK表达;染色质免疫沉淀实验发现β-catenin可以与p28^GANK启动子区相互结合;4.HEK293细胞瞬时转染p28^GANK质粒可显著增强β-catenin/TCF4转录活性,而在HepG2、3B中抑制p28^GANK表达则可显著降低其转录活性;5.HEK293细胞中瞬时转染p28^GANK表达质粒可提高β-catenin入核蛋白水平,并在一定程度上稳定细胞中β-catenin总蛋白水平;腺病毒介导的干扰p28^GANK表达明显降低β-catenin蛋白水平,从而抑制了其下游的c-Myc和cyclinD1的表达水平;6.Western blot和免疫组化实验分析表明p28^GANK的蛋白水平在肝癌组织样品中与β-catenin、c-Myc和cyclinD1呈同向性表达;7.在HEK293和Hep3B中p28^GANK正向调节自身表达。结论:生长因子刺激或Ras激活可以上调肝癌癌蛋白p28^GANK的表达,这种激活作用可能是通过激活PI3K-AKT通路完成的。β-catenin和c-Myc的上调表达都能够促进p28^GANK的表达,并且染色质免疫沉淀实验证实β-catenin/TCF4可以与p28^GANK启动子直接结合。进一步实验表明上调的p28^GANK可以反过来进一步促进β-catenin蛋白的稳定从而上调β-catenin/TCF4转录活性。在肝癌组织样品中p28^GANK的蛋白水平与β-catenin、c-Myc和cyclinD1呈同向性表达。上述结果支持我们提出的p28^GANK正反馈调节β-catenin信号通路的结论。第二部分信号调节蛋白α负性调节Ⅰ型干扰素产生的作用和机制研究研究背景信号调节蛋白α（signal regulatory proteinα,SIRPα）是一种广泛存在的抑制性受体,属于免疫球蛋白受体超家族。其胞外区具有三个Ig样结构域和多个糖基化位点,胞内区带有免疫受体酪氨酸抑制基元（ITIMs）,其中含四个酪氨酸残基,被磷酸化后能够募集含SH2结构域的蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。干扰素（interferon IFN）是一类广泛表达具有潜在抗病毒感染的细胞因子。但是过度失控的诱导产生IFN还将易导致自身免疫性疾病的发生。所以,对于IFN表达系统的调控对于维持机体内稳态相当重要。IFN的诱导产生依赖于机体模式识别（pattern recognition receptors PRRs）受体的激活。天然免疫系统识别病毒双链RNA可以通过两条途径:TOLL样受体（toll like receptors,TLR）3和胞浆途径（RIG-I/MDA5）。TLR3作为一种重要的模式识别受体,主要表达于巨噬细胞和树突状细胞内涵体内,能够识别细胞吞噬进入的dsRNA。RIG-I/MDA5能够识别病毒复制过程中产生的dsRNA。TLR3和RIG-I/MDA5都能够与dsRNA的类似物poly（I:C）（polyriboinosinic:polyribocytidylic acid）结合,从而介导Ⅰ型IFN产生。本课题主要探讨了SIRPα对poly（I:C）活化巨噬细胞的调节作用和机制。SIRPα在免疫细胞只选择性地表达在巨噬细胞和树突状细胞等非淋巴细胞。我们研究发现poly（I:C）刺激巨噬细胞SIRPα蛋白表达水平下降,提示该蛋白对巨噬细胞激活及Ⅰ型IFN产生可能存在抑制作用。为进一步了解该蛋白在天然免疫功能中的作用和机制,本课题通过转染并筛选克隆建立稳定高低表达该蛋白的巨噬细胞系及瞬时干扰小鼠体内分离的巨噬细胞中的SIRPα表达,探讨了SIRPα对poly（I:C）诱导的小鼠巨噬细胞活化的影响,全面探讨了SIRPα对TLR3和胞浆途径介导的Ⅰ型IFN产生的调节作用;并探讨SIRPα对巨噬细胞MAPKs信号分子,分泌细胞因子的影响,并进一步探讨了SIRPα发挥上述作用的可能机制,确定了SIRPα在Ⅰ型干扰素诱导产生中的重要调节作用,并为尚未阐明的抑制性受体家族胞内信号转导机制提供新的线索。实验方法1.建立稳定转染空载体,高表达Myc-SIRPα及稳定干扰SIRPα的巨噬细胞系:RAW-VT,RAW-OV,RAW-KD,设计,合成并鉴定具有干扰效果的stealthRNA,分别干扰SIRPα,和SHP-2;2.采用磷酸化特异性抗体检测不同SIRPα表达对poly（I:C）刺激后p38,JNK,ERK,IRF3及AKT磷酸化水平的变化的影响来反映SIRPα对通路活化的影响;3.运用荧光素酶报告基因系统检测SIRPα对ISRE、PRDⅡ、PRDⅢ-Ⅰ、RANTES和NF-κB转录活性的作用;4.采用Real-time PCR方法检测sirpa基因转录水平变化和RT-PCR检测ifn-β及其相关诱导基因变化;5.通过ELISA检测细胞因子变化;6.采用免疫沉淀的方法确定与SIRPα相互作用的蛋白。7.采用瞬时干扰SHP-2后检测其对巨噬细胞释放细胞因子和对信号通路磷酸化的影响确定这个蛋白在巨噬细胞激活中的作用。8.采用免疫共沉淀的方法检测SIRPα不同表达是否影响SHP-2和下游相互作用蛋白的结合。结果1.Poly（I:C）刺激后对SIRPα表达的影响:不同的小鼠巨噬细胞系和小鼠体内分离的巨噬细胞给予不同剂量的poly（I:C）和不同时程的poly（I:C）刺激后均可见SIRPα表达明显下调,Real-time PCR结果表明poly（I:C）引起的SIRPα表达下调主要是转录水平的下调。2.SIRPα对poly（I:C）刺激后IRF3磷酸化及IFN相关转录因子活性的影响:研究发现SIRPα高表达可显著抑制poly（I:C）诱导的巨噬细胞细胞IRF3磷酸化水平,并抑制IFN相关转录因子结合位点PRDⅡ、PRDⅢ-Ⅰ及ISRE活性。SIRPα低表达则可显著提高巨噬细胞IRF3磷酸化水平和IFN相关转录因子活性。3.SIRPα对TLR3激活的IFN-β及诱导基因表达的影响:报告基因,PCR分析和细胞因子测定结果表明,SIRPα对TLR3激活的Trif通路诱导IFN-β及其诱导基因的表达和其他促炎因子都有明显的抑制作用。4.SIRPα对poly（I:C）刺激后的MAPK、NF-κB和JAK-STAT信号途径的作用:SIRPα低表达可显著提高poly（I:C）引起的MAPK信号通路的激活,ERK、JNK和p38磷酸化水平都显著增强。SIRPα低表达组IκBα磷酸化增强,NF-kB活性明显高于对照组。SIRPα表达抑制组巨噬细胞STAT1磷酸化水平显著高于对照组,iNOS活性及诱导产生的NO水平明显高于对照组。5.SIRPα对poly（I:C）激活的胞浆信号途径影响:HEK293细胞中瞬时表达SIRPα可显著抑制瞬转poly（I:C）引起的IRF3的磷酸化水平;SIRPα高表达显著抑制瞬转poly（I:C）引起的IFN-β的表达;HEK293中SIRPα表达显著抑制poly（I:C）引起STAT1磷酸化水平;RT-PCR分析表明SIRPα高表达显著抑制瞬转poly（I:C）引起的IFN-β及其诱导基因的转录。6.SIRPα的抑制作用依赖于ITIM基序的磷酸化及与SHP2的结合:报告基因分析表明不同剂量SIRPα表达不能抑制Trif或TBK1激活的IFN-β表达。SIRPαITIM突变体不能抑制poly（I:C）引起的IFN-β的表达,证明这种抑制作用依赖于ITIM基序的磷酸化并可能有SHP2的参与。7.SIRPα对TLR3和胞浆途径IFN-β表达的影响机制:P13K抑制剂可显著抑制TLR3和胞浆途径介导的ISRE活性及IFN-β表达水平。说明PI3K信号途径可能在IFN表达中有正性调节作用。SIRPα的表达可抑制TLR3和胞浆途径介导的poly（I:C）引起AKT的磷酸化水平。免疫共沉淀实验发现SIRPα可以与PI3Kp85亚基形成复合体,并且这种结合是依赖于poly（I:C）刺激的。所以SIRPα发挥抑制作用可能正是通过磷酸化后募集PI3K,引起AKT不完全活化,这直接导致了IRF3的磷酸化水平降低,从而减少了IFN-β的表达。结论本研究从分子水平全面深入研究了信号调节蛋白SIRPα对TLR3和胞浆途径介导的Ⅰ型干扰素表达的调节作用,发现SIRPα对poly（I:C）诱导的Ⅰ型干扰素及其它细胞因子分泌等生物学行为具有负向调控能力,详细探讨了其影响相关信号转导通路的作用机制,证明其可能部分通过抑制PI3K-AKT信号通路调节作用而发挥负向调控作用。