米曲霉（Aspergillus oryzae）是食品发酵行业重要的生产菌株,拥有悠久的安全使用历史,同时也是工业生产重要的菌株,具有良好的蛋白分泌和生产能力,用于生产商品酶和次级代谢物。米曲霉的孢子有多种核型,多数孢子为多核,少数孢子为单核,这给菌种改造和工业育种带来了困难,因为多核特性会稀释遗传操作产生的表型效应,异核转化子会使重组蛋白的表达水平下降等。本实验室前期在米曲霉FS1125中已经建立成熟的分离技术分离富集其单核群体和多核群体,利用双向电泳技术筛选了45个单核分生孢子和多核分生孢子孢内的差异表达蛋白,并利用蛋白质谱技术对这些蛋白进行鉴定和初步的生物信息学分析。基于以上背景,本研究拟对米曲霉核型变化的生化机制、遗传背景进行探索。粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）作为丝状真菌的模式菌株,其研究结果可应用于其他丝状真菌,且粗糙脉孢霉分生孢子也具有多种核型的特点。本研究利用粗糙脉孢霉相应基因型的缺陷株对编码这些核型差异表达蛋白的基因进行初步的筛选。通过荧光显微技术及血球计数分析了各缺陷株和野生株在同等培养条件下其孢子核型的分布和数目,结果获得了四株与野生株核型具有显著差异的缺陷株,分别是F187、F188、F192、F193,因此后续选择这四株缺陷株对应的基因在粗糙脉孢霉中进行进一步回补验证。由于粗糙脉孢霉具有不同性型,缺陷株F187与F188为同一基因（npc）敲除株的不同性型,F192与F193则为另一基因（ftt）敲除株的不同性型缺陷株。为验证这两基因的功能,需要进行回补验证。本研究在相应基因的表达框两侧连上csr-1基因的上下游侧翼,分别构建了npc基因和ftt基因的回补载体,通过基因重组将目的基因插入csr-1位点,目的基因置换csr-1基因后赋予了回补株对环孢霉素的抗性,利用环孢霉素成功地筛选到回补菌株。基因回补后分别测定野生株、回补株和缺陷株的生长速率和纤维素酶（滤纸）酶活,并对结果进行差异显著性分析。结果表明缺陷株的生长速率和纤维素酶酶活与回补株、野生株相比具有显著差异,而回补株与野生株之间没有显著差异,说明回补菌株生长速率和纤维素酶活的表型功能恢复。后期需要在米曲霉中敲除这些基因,验证这些基因是否对米曲霉核型分布也具有显著影响。为此需要开发适用于米曲霉的遗传转化系统,构建适于米曲霉的筛选遗传标记。研究表明,编码麦角固醇合成的关键酶基因erg1的过表达可以产生对抗真菌药物特比萘芬的抗性。本研究首先进行米曲霉对特比萘芬的抗性实验,确定了特比萘芬对米曲霉的最低抑制浓度为0.8μg/mL。利用组成型启动子pgkA驱动erg1基因过表达成为选择标记,在其两侧连上pyrG的上下游同源序列,并与骨架相连构成质粒。以此质粒为模板,根据靶向敲除原理构建两个分裂片段转化米曲霉,获得了特比萘芬抗性和尿嘧啶营养缺陷双筛选标记菌株。以上结果为后续在米曲霉中的遗传操作奠定了基础。