【摘 要】
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背景:肺癌仍占据全球癌症死亡原因的很大比例,而其中大多数患者为非小细胞肺癌。多年来大量临床和实验研究使得肺癌死亡率有所下降,然而为了进一步提高肺癌患者的生存率和生活质量,仍需开发研究有效的肺癌治疗药物。中医药治疗癌症的进展有目共睹,标本兼治、扶正益气、祛痰化瘀、祛邪解毒等治则治法在临床上广泛应用。课题组基于此创立了活血化瘀配合扶正益气的丹参-人参组分复方,以期应用于癌症的治疗,但其效用和机制还需进
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背景:肺癌仍占据全球癌症死亡原因的很大比例,而其中大多数患者为非小细胞肺癌。多年来大量临床和实验研究使得肺癌死亡率有所下降,然而为了进一步提高肺癌患者的生存率和生活质量,仍需开发研究有效的肺癌治疗药物。中医药治疗癌症的进展有目共睹,标本兼治、扶正益气、祛痰化瘀、祛邪解毒等治则治法在临床上广泛应用。课题组基于此创立了活血化瘀配合扶正益气的丹参-人参组分复方,以期应用于癌症的治疗,但其效用和机制还需进一步验证和研究。本文预期从生物标志物与泛素化的崭新角度出发,利用网络药理学技术和生物学实验来验证丹参-人参组分复方的抗非小细胞肺癌效果和其内在的分子作用机制。目的:验证丹参-人参组分复方的抗非小细胞肺癌作用,并探究其是否能通过调控DTL-PDCD4/JNK通路来发挥抗非小细胞肺癌作用。方法:1.MTT法检测丹参-人参组分复方对肺正常细胞和非小细胞肺癌细胞活性的影响。2.克隆形成检测丹参-人参组分复方对肺正常细胞和非小细胞肺癌细胞增殖的影响。3.划痕实验检测丹参-人参组分复方对非小细胞肺癌细胞迁移的影响;Transwell实验检测丹参-人参组分复方对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭的影响。4.分子对接技术预测丹参-人参组分复方和DTL蛋白的结合力。5.生物膜干涉技术验证丹参-人参组分复方和DTL蛋白的相互作用关系。6.网络药理学筛选丹参-人参组分复方活性成分和靶点及通路预测:TCMSP、HERB、SymMAP数据库结合文献筛选丹参-人参组分复方的活性成分;NPASS、DRUGBANK数据库预测活性成分靶点;KEGG和GO富集分析预测活性成分靶点的作用通路。IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析重要靶点及其对应成分与DTL之间的联系。7.RT-qPCR实验检测丹参-人参组分复方对A549非小细胞肺癌细胞中DTL-PDCD4/JNK信号通路相关基因表达水平的影响。8.Western-blot实验检测丹参-人参组分复方对A549非小细胞肺癌细胞中DTL-PDCD4/JNK信号通路相关蛋白表达水平的影响。结果:1.MTT实验结果表明丹参-人参组分复方能够抑制非小细胞肺癌细胞A549、H1299、95D、H1975、H460的活性而对肺正常细胞BEAS-2B无显著影响。2.克隆形成实验表明丹参-人参组分复方能够对非小细胞肺癌细胞A549、H1299、95D、H1975、H460有增殖抑制作用而对肺正常细胞BEAS-2B无显著影响。3.划痕实验表明丹参-人参组分复方可以抑制非小细胞肺癌细胞A549、H1299、95D、H1975、H460的迁移;Transwell实验表明丹参-人参组分复方可以抑制非小细胞肺癌细胞 A549、H1299、95D、H1975、H460 的迁移和侵袭。4.分子对接模拟预测了丹参-人参组分复方的小分子成分与DTL蛋白具有相互作用关系,其中丹酚酸A、丹酚酸Y和人参皂苷Rf与DTL蛋白有较强的结合力。5.生物膜干涉技术验证了 DTL蛋白与丹参-人参组分复方及其各类组分丹参总酚酸、人参总皂苷、人参多糖都分别具有较强的相互作用关系。6.网络药理学靶点及通路预测结果:（1）TCMSP、HERB、SymMAP数据库结合文献筛选丹参-人参组分复方的活性成分共40个;（2）在NPASS和DRUGBANK数据库搜集活性成分预测靶点共192个;（3）KEGG富集分析显示丹参-人参组分复方活性成分靶点主要富集于癌症通路,MAPK信号通路,松弛素信号通路和催乳激素信号通路;（4）在DisGeNet、DrugBank、Genecards数据库中获取非小细胞肺癌相关的靶点信息共716个;（5）丹参-人参组分复方成分的靶点与非小细胞肺癌靶点的交集靶点共38个,蛋白-蛋白相互作用分析显示EGFR、AKT1、MAPK1、ESR1、SRC等有较高的连接度。IPA分析显示丹参-人参组分复方活性成分在MAPK通路上的靶点基因与PDCD4及DTL具有直接或间接关系。7.RT-qPCR实验表明丹参-人参组分复方下调A549非小细胞肺癌细胞中DTL基因和MAP4K1、JNK、c-Jun、c-Myc基因表达水平,上调PDCD4和p53基因表达水平。8.Western-blot实验结果显示丹参-人参组分复方显著下调A549非小细胞肺癌细胞中DTL、MAP4K1及磷酸化JNK、磷酸化c-Jun蛋白的表达水平,上调PDCD4和p53蛋白表达水平。结论:丹参-人参组分复方能够影响非小细胞肺癌的活性,抑制其增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与调控DTL-PDCD4/JNK信号通路有关。
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