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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致食源性疾病的常见细菌之一，它通过分泌肠毒素作用于肠道细胞受体，产生恶心、呕吐、痉挛性疼痛、腹泻、休克综合征和心内膜炎等食物中毒症状。由S.aureus污染引起的食物性中毒对人类的生命健康构成了重大威胁，传统的检测方法基于选择培养法和酶联免疫吸附法(ELISA)，这些方法检测时间长、灵敏度低，并且涉及复杂的样品制备过程，严重限制了S.aureus的检出和报告。因此，开发出一种快速、灵敏的S.aureus检测方法对由其引起的食源性疾病的日常检测至关重要。
本研究利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对靶序列的放大作用以及含有G4基序的分子信标(G4-molecular beacon，GMB)对扩增产物的特异性识别作用，构建了基于LAMP-GMB化学发光传感器检测S.aureus的方法;基于适体对靶菌体的特异性识别作用以及切口酶扩增反应(Nicking enzyme amplification reaction，NEAR)和滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)两步放大循环，构建了基于适体传感器快速检测S.aureus的方法。两种传感器均以G四链体(G-quadruplex，G4)和血红素形成的G4-血红素复合物为信号转换单元，其具有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)拟酶活性，能够氧化鲁米诺产生化学发光检测信号。具体研究结果如下:
(1)基于LAMP-GMB的S.aureus化学发光传感器的构建。以S.aureus特有的耐热核酸酶(Thermonuclease，TNase)编码基因nuc为靶点，设计特异性引物，利用LAMP扩增对检测信号进行放大。LAMP的扩增产物是在同一条DNA链上靶序列周而复始形成的长短不一的片段，选取其中22bp作为GMB探针的识别位点，设计GMB检测探针，使G4基序“隐藏”在分子信标的互补区域，通过分子信标的“开关作用”来控制检测信号的输出。当LAMP特异性扩增出目的片段时，高浓度的甜菜碱溶液会使其DNA双链结构呈半解离状态，从而便于GMB探针识别并结合在扩增产物的靶序列上，同时“打开”茎环结构并释放出完整的G4基序。G4在一定浓度K+条件下形成G4空间构型，结合血红素构成G4-血红素复合物，催化H2O2的还原和鲁米诺底物的氧化，从而产生化学发光反应，实现对S.aureus的定量检测。优化的传感器条件为:LAMP内外引物比为内引物∶外引物=6∶1;LAMP反应温度63℃，时间50min;GMB探针杂交条件为50℃，20min;K+浓度为80mM;血红素浓度为1.2μM。在优化的条件下，该方法的检测限(Limit of detection，LoD)为10fg/μL基因组DNA，并且在101-105fg/μL的浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为R2=0.9882。采用碱性聚乙二醇裂解法(Alkaline polyethylene glycol-based method，PEG-OH)对加标牛奶样品的DNA进行提取，其裂解液可以直接应用于下游检测过程，避免了DNA纯化和pH调节的步骤，将DNA提取时间缩短至10min以内。对加标样品的实验结果表明该方法的LoD为50CFU/mL，在5×101-5×107CFU/mL的浓度范围内具有良好的线性相关关系，回归方程为Y=0.2667X-0.1398，线性相关系数为R2=0.9893。
(2)基于NEAR-RCA等温放大循环的S.aureus适体传感器的构建。本研究选取S.aureus特异性适体，将适体与检测探针相结合组成传感器的识别单元，即适体.探针（aptamer-probe，AP）。当S.aureus存在时，利用其与适体的特异性识别和结合作用，将检测探针从AP中置换出来，使其游离在溶液中。游离的探针序列作为下游等温扩增循环的引物，起始NEAR-RCA信号放大过程，产生大量含有G4基序的单链DNA扩增产物。形成G4-血红素复合物诱导鲁米诺化学发光信号，实现对S.aureus特异性检测。结果表明，建立的适体生物传感器在5-104CFU/mL的浓度范围内具有良好的线性相关性，回归方程为Y=0.1389X+1.0432，相关系数为R2=0.9220。该传感器通过NEAR-RCA两步等温扩增产生的化学发光值，明显高于单独依赖RCA放大循环的响应值，这显著提高了传感器灵敏度，可以检测低至5CFU/mL的靶菌体。更为重要的是，本研究建立的适体传感器可以特异性识别活性的S.aureus菌体，表现出对灭活和活的S.aureus良好的区分能力。
该研究建立了两种S.aureus快速检测方法，均实现了对目标菌株特异性和高灵敏度检测，操作过程简单，为开发简便快速、成本低廉的现场金黄色葡萄球菌检测方法、制定统一的检测标准提供了参考，同时，本研究构建的快速检测传感器对食品领域其他食源性致病菌的检测也具有潜在的应用价值。
本研究利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对靶序列的放大作用以及含有G4基序的分子信标(G4-molecular beacon，GMB)对扩增产物的特异性识别作用，构建了基于LAMP-GMB化学发光传感器检测S.aureus的方法;基于适体对靶菌体的特异性识别作用以及切口酶扩增反应(Nicking enzyme amplification reaction，NEAR)和滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)两步放大循环，构建了基于适体传感器快速检测S.aureus的方法。两种传感器均以G四链体(G-quadruplex，G4)和血红素形成的G4-血红素复合物为信号转换单元，其具有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)拟酶活性，能够氧化鲁米诺产生化学发光检测信号。具体研究结果如下:
(1)基于LAMP-GMB的S.aureus化学发光传感器的构建。以S.aureus特有的耐热核酸酶(Thermonuclease，TNase)编码基因nuc为靶点，设计特异性引物，利用LAMP扩增对检测信号进行放大。LAMP的扩增产物是在同一条DNA链上靶序列周而复始形成的长短不一的片段，选取其中22bp作为GMB探针的识别位点，设计GMB检测探针，使G4基序“隐藏”在分子信标的互补区域，通过分子信标的“开关作用”来控制检测信号的输出。当LAMP特异性扩增出目的片段时，高浓度的甜菜碱溶液会使其DNA双链结构呈半解离状态，从而便于GMB探针识别并结合在扩增产物的靶序列上，同时“打开”茎环结构并释放出完整的G4基序。G4在一定浓度K+条件下形成G4空间构型，结合血红素构成G4-血红素复合物，催化H2O2的还原和鲁米诺底物的氧化，从而产生化学发光反应，实现对S.aureus的定量检测。优化的传感器条件为:LAMP内外引物比为内引物∶外引物=6∶1;LAMP反应温度63℃，时间50min;GMB探针杂交条件为50℃，20min;K+浓度为80mM;血红素浓度为1.2μM。在优化的条件下，该方法的检测限(Limit of detection，LoD)为10fg/μL基因组DNA，并且在101-105fg/μL的浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为R2=0.9882。采用碱性聚乙二醇裂解法(Alkaline polyethylene glycol-based method，PEG-OH)对加标牛奶样品的DNA进行提取，其裂解液可以直接应用于下游检测过程，避免了DNA纯化和pH调节的步骤，将DNA提取时间缩短至10min以内。对加标样品的实验结果表明该方法的LoD为50CFU/mL，在5×101-5×107CFU/mL的浓度范围内具有良好的线性相关关系，回归方程为Y=0.2667X-0.1398，线性相关系数为R2=0.9893。
(2)基于NEAR-RCA等温放大循环的S.aureus适体传感器的构建。本研究选取S.aureus特异性适体，将适体与检测探针相结合组成传感器的识别单元，即适体.探针（aptamer-probe，AP）。当S.aureus存在时，利用其与适体的特异性识别和结合作用，将检测探针从AP中置换出来，使其游离在溶液中。游离的探针序列作为下游等温扩增循环的引物，起始NEAR-RCA信号放大过程，产生大量含有G4基序的单链DNA扩增产物。形成G4-血红素复合物诱导鲁米诺化学发光信号，实现对S.aureus特异性检测。结果表明，建立的适体生物传感器在5-104CFU/mL的浓度范围内具有良好的线性相关性，回归方程为Y=0.1389X+1.0432，相关系数为R2=0.9220。该传感器通过NEAR-RCA两步等温扩增产生的化学发光值，明显高于单独依赖RCA放大循环的响应值，这显著提高了传感器灵敏度，可以检测低至5CFU/mL的靶菌体。更为重要的是，本研究建立的适体传感器可以特异性识别活性的S.aureus菌体，表现出对灭活和活的S.aureus良好的区分能力。
该研究建立了两种S.aureus快速检测方法，均实现了对目标菌株特异性和高灵敏度检测，操作过程简单，为开发简便快速、成本低廉的现场金黄色葡萄球菌检测方法、制定统一的检测标准提供了参考，同时，本研究构建的快速检测传感器对食品领域其他食源性致病菌的检测也具有潜在的应用价值。