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猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是一种单链环状DNA病毒,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为主的猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的关键病原分子(Karuppannan and Opriessnig 2017)。被PCV2感染的猪,可发生免疫抑制,天然免疫应答减弱,对多种病原易感,导致严重的多病原混合感染,病死率高,给养猪业造成了巨大的经济损失。通常,病毒感染机体后会被机体识别并引起相应的免疫应答,cGAS/STING作为一种关键的DNA感受通路,在机体抗病毒免疫反应以及一些炎性因子的分泌过程中发挥重要作用,但是cGAS、STING在PCV2感染机体引起机体免疫抑制的过程中怎样发挥作用目前还没有研究报道。本试验以PK-15细胞作为基因编辑的模式细胞,运用靶向于猪c GAS基因和sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒敲除系统感染野生型PK-15细胞,并用适当浓度的嘌呤霉素进行筛选,得到阳性单克隆细胞,经过扩大培养,成功获取了cGAS基因敲除细胞系和sting基因敲除细胞系,以相同滴度的PCV2分别感染野生型PK-15细胞、cGAS基因敲除细胞和sting基因敲除细胞,通过Real-time PCR和ELISA等方法检测PCV2感染细胞后,细胞因子IFN-β、IL-6、IL-1β的变化以及病毒复制量的变化。研究取得以下实验结果:1.利用CRISPR-Cas9基因敲除系统成功得获取了一株cGAS基因敲除细胞和一株sting基因敲除细胞。在靶向于cGAS基因376位点构建的cGAS基因敲除细胞中,CDS区第277-284位碱基缺失,共缺失了7个碱基,导致后面序列发生移码,cGAS蛋白第92位-第111位氨基酸都发生了突变,并在第111位氨基酸移码终止;在靶向于sting基因196位点构建的sting基因敲除的PK-15细胞中,sting基因的第194-198位碱基缺失,后面的序列发生移码突变,导致从65位氨基酸开始,氨基酸序列也出现多处突变。Western blotting结果显示,靶向于cGAS基因376位点构建的敲除细胞检测不到cGAS蛋白的表达,靶向于sting基因196位点构建的敲除细胞检测不到STING蛋白的表达。2.PCV2分别感染野生型PK-15细胞,cGAS敲除的PK-15细胞(376PK-15cGAS-/-)和sting敲除的PK-15细胞(196PK-15STING-/-),Real-time PCR结果显示,与野生型PK-15细胞相比较,cGAS基因缺失会在PCV2感染的6 h~24 h均使IL-6、IL-1β表达量显著升高;cGAS基因缺失,在PCV2感染的初期(6 h、12 h),对细胞内IFN-βmRNA表达水平没有明显影响,在感染PCV2 24 h时,使IFN-β的mRNA水平显著升高;sting基因缺失会在PCV2感染的6 h~24 h均使IL-6、IFN-βmRNA水平显著升高,而对IL-1βmRNA水平没有显著影响。ELISA结果与Real-time PCR结果一致。检测cGAS、STING缺失对PCV2复制的影响发现,PCV2在cGAS基因敲除细胞和sting基因敲除细胞中的复制速度均显著低于在其野生型PK-15细胞中的复制速度。综上实验结果可知,本研究说明cGAS、STING均参与PCV2感染诱导的免疫应答过程,cGAS在PCV2感染PK-15细胞中可能参与调控炎症小体的形成过程以及PCV2感染引起的炎症反应。而STING更加偏向于参与调控PCV2感染所引起的抗病毒免疫反应以及I型干扰素的产生过程,并且这两个蛋白均为调控PCV2引起的炎症反应、抗病毒反应的上游分子,cGAS和STING的缺失均会对PCV2复制产生影响。