畜牧业中β2-激动剂的违禁使用问题一直是国内外关注的热点,当前虽然已经基于β2-激动剂的违禁使用建立了很多检测方法,如仪器法、免疫法、传感器法等,但是现有方法都是基于已知药物。β2-激动剂类药物种类多、更新快,在畜牧生产中使用了新的β2-激动剂类药物,则上述已建立的方法检测不出来,这些有问题的动物、畜产品将躲过监管部门的监测,进入食物链,危害消费者的健康。因此,有必要建立更为灵敏有效的方法,以实现对该家族药物中逃逸药物尤其是新药的检测。β2-激动剂类药物有着共同的作用机理,研究β2-激动剂类药物在分子水平对动物生理的影响,不仅可以发现同家族中已知的药物,而且可以实现对新药和逃逸药物的监测。在之前的研究中,我们已经确立了一组转录水平的生物标志物（mRNA）用于实验山羊中β2-激动剂违禁使用的监测。miRNA（microRNA）是真核生物中广泛存在的一种长度为21-23nt的RNA分子,与mRNA相比更稳定,且可以调控mRNA的表达,更加灵敏,是更适合监测动物使用β2-激动剂类药物的候选生物标志物。因此本论文以miRNA为研究对象,通过体内外试验,寻找到了一组miRNA作为标志物用于监测使用了β2-激动剂类药物的山羊,探讨了所发现的miRNA在β2-肾上腺素能受体基因（ADRB2）代谢通路中的调控作用,旨在为畜牧生产中监测β2-激动剂类药物违禁使用,建立更为高效、灵敏、快捷的方法。主要研究内容与结果如下:1.首先进行了体外实验,对β2-激动剂相关miRNA标志物进行了初步筛选与验证。选取了mi RNA测序技术进行了用β2-激动剂处理的肌细胞中实验组和对照组中差异表达mi RNA的筛选,qRT-PCR结果表明实验组与对照组相比,所选miRNAs（let-7a-5p,let-7c-5p,let-7e-5p,let-7f-5p,mi R-15a-5p,miR-30a-5p,miR-98-5p,miR-195-5p,miR-99b-5p和miR-1271-5p）的上下调趋势与测序结果一致,DD-SIMCA及聚类热图分析表明该组标志物可以区分对照组和不同浓度（莱克多巴胺和克伦特罗终浓度分别为80、40、20、10、5ng/m L）的β2-激动剂处理的实验组细胞样本。结合靶基因生信预测及与之前的差异基因（FOXO1,mTOR,ATP2A3,PDE4C,ADRB2,IGF-1,MYLK,PTH,GPR,ADCY3,PRKACB,和IL1B）建立联系,明确了山羊体外β2-激动剂相关mi RNA-mRNA调控网络。2.然后开展了体内实验,对体外选取β2-激动剂相关miRNA标志物进行了验证。通过对山羊给药后,统计学结果表明与对照组相比,不同处理时间山羊肌肉（给药第7天、14天、21天,停药第0天、1天、3天、7天、14天、21天）中miRNA上下调趋势与体外实验一致,DD-SIMCA及热图分析结果表明10个miRNAs可以通过肌肉组织区分β2-激动剂处理组和对照组样本。体内实验结果与体外实验一致,表明该组mi RNA标志物可作为监测肉羊生产中β2-激动剂违禁使用的生物标志物。基于该组mi RNAs标志物,进一步进行β2-激动剂处理的山羊（实验组和对照组）尿液中标志物有效性的测试,统计学结果显示该组miRNAs标志物可以区分山羊空白尿液和用β2-激动剂处理的山羊尿液两组样品。以上结果表明,10个候选miRNAs标志物可以基于肌肉和尿液监测山羊中β2-激动剂的使用,可以作为监测山羊中β2-激动剂违禁使用的生物标志物。3.进而明确了所选的miRNA在β2-肾上腺素能受体基因ADRB2中的调控关系,从转录调控角度验证了β2-激动剂相关miRNA标志物的有效性。以该类药物mRNAs及miRNAs标志物为研究对象,通过第二章和第三章的实验数据及生物信息学分析结果,预测ADRB2基因受let-7a-5p、let-7c-5p、let-7e-5p、let-7f-5p、miR-15a-5p、miR-30a-5p及miR-98-5p的调控。该预测通过细胞转染、双荧光素酶试验及VIP分析也得到了确证:miR-mimic转染细胞后可显著下调ADRB2的表达,下调范围在45.5%-69.7%之间,miR-inhibitor转染组可以显著增加ADRB2的表达水平,上调范围在29.8%-182.1%之间;当同时转染ADRB2-3’UTR-WT（野生型）和mimics后,与共转ADRB2-3’UTR-WT（野生型）和miRNA-mut（突变型,NC）和组相比,各组荧光素酶活性显著降低,其中,以let-7f-5p（74.3%）、miR-30a-5p（76.5%）和let-7a-5p（72.5%）降低水平为最高。结果表明,ADRB2基因受let-7a-5p、let-7c-5p、let-7e-5p、let-7f-5p、miR-15a-5p、miR-30a-5p及miR-98-5p的调控,且ADRB2基因的3’UTR区是以上miRNA的靶位点。以上结果阐明了所选mi RNA在ADRB2基因调控中的生物学意义,为确定其作为监测β2-激动剂类药物的生物标志物提供了更可靠依据。4.最后结合代谢组学技术进行了与β2-激动剂相关基因下游代谢物研究,明确了差异代谢物与mRNA水平标志物的调控关系,从而以mRNA水平标志物为中介,明确了与β2-激动剂相关的mi RNA-mRNA-代谢物之间的调控关系,从下游代谢物角度进一步验证了β2-激动剂相关miRNA标志物的有效性。基于非靶向代谢组学技术,揭示了β2-激动剂在山羊肌肉细胞中的代谢图谱,建立了基于超高效液相色谱-飞行时间质谱监测肌肉细胞中β2激动剂的非靶向代谢组学方法。经过Peakview软件提取差异信息,以及化学计量学分析如PCA及OPLS-DA,结果显示这些差异信息能用来显示β2激动剂在肌肉细胞中的存在。HMDB及XCMS定性结果和软件定量结果显示,与对照组相比,克伦特罗和联合组处理组中L-亮氨酸、甘油磷酸胆盐、硬脂酰胺、植物鞘氨醇、神经鞘氨醇、L-赖氨酸、甜菜碱、L-苯丙氨酸等呈现上调,上调倍数在2.985（精氨琥珀酸）到10.723（赖氨酸）之间;肌酸、油酸酰胺、胆碱、L-酪氨酸、胆固醇、和1-磷酸鞘氨醇等显示下调,其中以L-酪氨酸下调倍数最高（-7.892）。以上结果表明,大部分差异代谢产物与脂肪酸代谢和氨基酸代谢有关,这些代谢物有可能为解释由β2-激动剂引起的能量重分配机制提供新的思路。同时,结合之前研究中的转录水平标志物和KEGG代谢通路,进一步明确了β2-激动剂相关miRNA和代谢物之间的调控关系。