传统化疗药物由于不能在肿瘤部位高度富集及其毒副作用,影响其治疗效果。纳米载药系统能提高化疗药物在肿瘤组织的渗透和滞留,但仍面临肿瘤部位的蓄积不多和不能深部穿透等问题,也不能将药物进一步靶向肿瘤深部存在的肿瘤再生细胞（tumour repopulating cells,TRCs）。因此理想的靶向TRCs的纳米药物需克服体内系列生理屏障并被TRCs有效摄取。微颗粒（microparticles,MPs）是细胞受到应激时释放的一种胞外囊泡,由于具有良好的生物相容性、内在靶向性和较低的免疫原性,是一种极具潜力的药物传递载体。文献报道普通肿瘤细胞来源的MPs（2D-MPs）负载抗肿瘤药物能大量杀死肿瘤细胞,临床研究呈现优良的抗肿瘤效果。基于纳米载药系统生物力学特性,如软硬度深刻影响纳米药物体内过程的认识,本文利用三维软纤维蛋白胶（90 Pa）分选技术,制备了软的TRCs来源的MPs（3D-MPs）。研究发现3D-MPs比2D-MPs更加柔软,并具有更强的形变能力。在体内和体外实验中,我们发现这种软的3D-MPs能更多在肿瘤组织蓄积,更容易穿越肿瘤血管进入肿瘤深部,并且更多地被TRCs摄取,因而负载药物能发挥更优良的抗肿瘤效果。进一步研究发现细胞骨架相关蛋白cytospin-A在调控3D-MPs软硬度中发挥重要的作用。本文主要研究内容以及结果如下:1、TRCs来源的载药3D-MPs的表征及药效学研究应用力学筛选的方法,在软三维纤维蛋白胶（90Pa）中培养得到了H22和B16-F10TRCs,并且成功在体外用无血清培养基扩大培养,得到大量的TRCs。将化疗药物与TRCs共孵育,并采用紫外线诱导,制备得到了载阿霉素（doxorubicin,DOX）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的DOX@3D-MPs和5-FU@3D-MPs,其载药量分别为每微克3D-MPs蛋白包载0.06μg DOX和0.04μg 5-FU。DOX@3D-MPs粒径约510-540nm,zeta电位为-25～-30mV,并且在生理环境下7d后仍能保持比较好的稳定性,在酸性的溶酶体环境下能比较多地释放药物。针对不同肿瘤模型,如不同肿瘤大小的H22皮下瘤模型以及B16-F10黑色素瘤肺转移模型,DOX@3D-MPs相比于游离的DOX、DOX@2D-MPs和高剂量的商品化脂质体阿霉素（Doxil）,都表现出更强的抗肿瘤效果。同时,3D-MPs包载其它化疗药物,如5-FU也在H22肝癌皮下瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果。并且相比高剂量Doxil的明显毒性,DOX@3D-MPs显示出很好的生物安全性,也不会在动物体内形成肿瘤。2、3D-MPs的体内过程研究DOX@3D-MPs在肿瘤组织高度富集,其在肿瘤部位富集量的药时曲线下面积（area under the curve,AUC）值大约是DOX、DOX@2D-MPs和Doxil的38.9、3.1和6.7倍。进一步的肿瘤组织切片分析发现,DOX@3D-MPs组在肿瘤组织血管外较远的区域有较多的DOX红色荧光信号,而游离DOX和Doxil组血管外区域几乎没有荧光信号。小鼠背部肿瘤皮窗模型和斑马鱼肿瘤模型也发现DOX@3D-MPs组中DOX很快从肿瘤血管渗出并渗透到肿瘤深部。体外肿瘤3D球模型也证实DOX@3D-MPs能深部穿透肿瘤组织。体外细胞实验结果表明,DOX@3D-MPs被肿瘤细胞和TRCs大量摄取,并且在较低的浓度下对肿瘤细胞和TRCs有强的杀伤效果,但其对RAW264.7巨噬细胞和ECV304内皮细胞的毒性很低。体内动物实验结果表明,相比于游离DOX、DOX@2D-MPs和高剂量的Doxil,DOX@3D-MPs在肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞中蓄积量最大,而在肿瘤巨噬细胞、基质细胞和免疫细胞中蓄积量很低。并且DOX@3D-MPs大量杀伤肿瘤细胞和TRCs,而较小引起巨噬细胞和内皮细胞的凋亡。通过胞内过程研究显示,这种细胞杀伤机制可能与DOX@3D-MPs进入细胞后先进入溶酶体,释放药物进入细胞核杀伤细胞有关。3、软硬度对3D-MPs体内过程影响的研究采用原子力显微镜发现3D-MPs的杨氏模量约为2D-MPs的1/3,说明3D-MPs较软。并且与2D-MPs相比,在低渗溶液中3D-MPs的粒径明显增大,而在高渗溶液中3D-MPs的粒径又显著缩小,说明3D-MPs具有良好的可变形性。动物和细胞实验发现,3D-MPs较2D-MPs有更多的肿瘤蓄积、更容易穿透肿瘤血管和穿透进入深部、更多地被肿瘤细胞及TRCs摄取。但是当用Jasplakinolide（Jasp,可诱导肌动蛋白聚合成微丝）处理3D-MPs使其变硬后,其在肿瘤部位蓄积、肿瘤深部穿透及被肿瘤细胞及TRCs摄取能力都降低,而Latrunculin A（LatA,阻断肌动蛋白聚合）处理2D-MPs使其变软后,其在肿瘤部位蓄积、肿瘤深部穿透及被肿瘤细胞及TRCs摄取能力均增加。并且发现巨噬细胞对3D-MPs的摄取要明显少于2D-MPs,但对Jasp处理的3D-MPs摄取增加,而对LatA处理的2D-MPs摄取减少。上述研究说明软硬度影响3D-MPs的体内过程,也为阐明载药3D-MPs具有更好抗肿瘤效果提供依据。4、调控3D-MPs软硬度的分子机制研究为了探讨3D-MPs柔软的分子机制,采用同位素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）方法对2D-MPs和3D-MPs的蛋白质组学进行分析,并采用western blot进行验证,发现cytospin-A在3D-MPs表达量比2D-MPs中低。采用siRNA干扰的方法抑制H22细胞内的cytospin-A的表达,发现抑制cytospin-A的表达后其分泌的MPs（2D-MPs cytospi-A siRNA）变得更加柔软,具有与3D-MPs相近的杨氏模量。动物实验发现,相对于2D-MPs,2D-MPs cytospi-A siRNA在肿瘤部位蓄积及深部穿透能力增强、被肿瘤细胞及TRCs的摄取增多。进一步将变软的2D-MPs cytospi-A siRNA包载DOX后,也发现DOX在肿瘤蓄积、肿瘤深部穿透、被肿瘤细胞及TRCs的摄取能力增强。且DOX@2D-MPs cytospin-A siRNA抗肿瘤效果显著强于DOX@2D-MPs,几乎和DOX@3D-MPs的药效相当。经DOX@2D-MPs cytospin-A siRNA治疗后,肿瘤组织中肿瘤细胞在三维软纤维蛋白胶（90Pa）中形成的肿瘤细胞球数量和大小明显降低,说明其对TRCs的杀伤明显增强。上述结果说明cytospin-A在调控MPs的软硬度、影响其体内过程及载药MPs的抗肿瘤效果上发挥重要作用。本文的研究将为软硬度可调的新型纳米载药系统构建提供新思路,并为发展一类新型高效的靶向TRCs载药系统提供依据。