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背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种侵袭性强、转移率高、预后差的恶性肿瘤,90%以上的原发性肝癌(primary livercancer,PLC)为肝细胞癌。据最新统计,在全球范围内,肝癌发病率位于癌症第6位,而死亡率位于第4位;在我国,肝癌在恶性肿瘤中发病率位居第四,死亡率位居第二;随着目前肝癌的治疗手段和技术在不断的提高,复发转移率和五年生存率有所改善,但是肝癌的转移复发的机理尚未完全阐明。很多研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)与肝癌的发生发展以及复发转移有关。据文献报道lncRNA-BC200在多种肿瘤中发挥着重要的作用,但是lncRNA-BC200在肝癌的表达以及在肝癌发生发展中的作用和机制的研究甚少。目的检测肝癌组织及癌旁组织中lncRNA-BC200的表达水平,分析患者的临床病理参数与lncRNA-BC200的表达水平之间的关系;明确lncRNA-BC200对肝癌细胞生物学功能的影响,探讨lncRNA-BC200可能的调控机制,为进一步寻找肝癌发生发展、复发转移的相关分子以及为靶向治疗提供理论依据。方法1、采用基因芯片技术,筛选肝癌组织及癌旁组织中,存在两倍及以上差异表达的lncRNA。用qPCR的技术原理制作lncRNA芯片,筛选5例肝癌组织和5例癌旁组织中lncRNA的表达谱,使用独立样本t检验统计筛选出差异表达lncRNA,并挑选出9条存在差异表达的lncRNA,利用qPCR方法分别检测其在5例肝癌组织和5例癌旁组织中的表达水平,并验证其结果与基因芯片结果的趋势是否一致。2、lncRNA-BC200在肝癌组织中的表达及与肝癌患者临床病理参数的关系。利用qPCR方法检测45对肝癌组织及其癌旁组织中lncRNA-BC200的表达水平,利用配对t检验分析lncRNA-BC200在肝癌组织和癌旁组织中是否存在差异表达。并收集45个肝癌患者的临床病理参数,利用卡方检验统计分析lncRNA-BC200的表达水平与肝癌患者各临床病理参数之间的关系。3、研究lncRNA-BC200在肝癌细胞中的功能作用及机制。首先,本研究利用CRISPRCas9基因编辑技术构建好的质粒,转染到HepG2细胞中,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞,并提取细胞总RNA,再用qPCR检测lncRNA-BC200的表达水平,对转染效率进行验证。进一步在细胞水平上利用CCK8实验、流式细胞技术、transwell实验等,检测lncRNA-BC200对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移的影响,并利用Western blot实验检测lncRNA-BC200对相关蛋白的影响。其次,利用慢病毒过表达的病毒液感染HepG2细胞,利用嘌吟霉素筛选出稳定转染的细胞,并提取细胞总RNA,利用qPCR检测lncRNA-BC200的表达水平,对感染效率进行验证。进一步在细胞水平上利用CCK8实验、流式细胞技术、transwell实验等检测lncRNA-BC200对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移的影响,并利用Western blot检测lncRNA-8C200对相关蛋白的影响。再者,将空白组的HepG2细胞、敲除lncRNA-BC200的HepG2细胞和过表达lncRNA-BC200的HepG2细胞分别注射到裸鼠后背右大腿皮下,注射一周后,每隔1周称量裸鼠的体重,8周后处死裸鼠取瘤,并称量切除肿瘤的体重和体积。最后,利用RNA pull-down技术联合蛋白质谱鉴定技术,筛选出可能与lncRNA-BC200结合的蛋白质。结果1、筛选出存在差异表达的lncRNA。基因芯片结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织有34个lncRNA表达上调,11个lncRNA表达下调。从具有差异表达的lncRNA中挑选9条lncRNA,应用qPCR方法在5例肝癌组织和5例癌旁组织中检测,结果表明,qPCR结果与基因芯片结果趋势一致,说明芯片结果具有可靠性。2、lncRNA-BC200基因在肝癌组织中高表达并与肝转移有关。45对肝癌组织及其癌旁组织中的qPCR结果显示,lncRNA-BC200在肝癌组织中的表达水平相比于其癌旁组织明显升高,表达差异具有统计学意义(p<0.05)。卡方检验分析发现lncRNA-BC200的表达与患者肝转移(p=0.041)、血清ALT浓度(p=0.048)密切相关,与年龄、性别、病理分级、肝硬化、术前血清AFP浓度、乙肝病毒感染、乙肝定量DNA、门静脉癌栓、肿瘤大小、BCLC分期、血清AST浓度、T淋巴细胞、B淋巴细胞均无关。3、lncRNA-BC200可以影响肝癌细胞的迁移、皮下肿瘤的生长、c-myc蛋白的表达,和可能结合hnRNPA2/B1蛋白。将通过CRISPR Cas9基因编辑技术构建好的质粒转染到HepG2细胞中,构建稳定转染的lncRNA-BC200敲除的HepG2细胞,在细胞水平上进行细胞功能实验,本实验结果表明,与空白组和对照组相比,敲除组的细胞迁移率明显降低,但细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖没有明显变化。Western blot结果表明,敲除lncRNA-BC200组相较于空白组和对照组,c-myc蛋白、bax蛋白表达下降,bcl-xl蛋白表达上升。将通过慢病毒过表达lncRNA-BC200的病毒液感染HepG2细胞,构建稳定感染的lncRNA-BC200过表达的HepG2细胞,在细胞水平上进行细胞功能实验,本实验结果表明,与空白组和对照组相比,过表达组的迁移率明显增高,但细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖没有明显改变。Western blot结果表明,过表达lncRNA-BC200组相较于空白组和对照组,c-myc蛋白、bax蛋白表达上升,bcl-xl蛋白表达下降。裸鼠皮下成瘤结果显示,过表达组的平均肿瘤体积最大(1.43±0.29cm3),敲除lncRNA-BC200组的平均肿瘤体积最小(0.49±0.36 cm3),差异具有统计学意义(p<0.05)。过表达组的平均肿瘤体重最重(2.0±0.16g),敲除组的平均肿瘤体重最轻(0.70±0.61g),差异具有统计学意义(p<0.05)。过表达组裸鼠体重生长速率低于敲除组,差异具有统计学意义(p<0.05)。RNA pull-down实验和蛋白质谱鉴定显示,有77个蛋白可能与lncRNA-BC200结合,其中鉴定到可能结合的蛋白有hnRNPA2/B1蛋白。结论1、lncRNA-BC200在肝癌组织中高表达。2、lncRNA-BC200与肝癌患者的癌细胞转移有关,提示可能与肝癌预后有关。3、lncRNA-BC200可能通过结合hnRNPA2/B1影响肝癌细胞的迁移能力和肿瘤的增殖。