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目的：通过细胞培养制备高纯度的骨髓间充质干细胞MSCs和完善科学的中药提取方法；应用 SD 大鼠制备短暂性脑缺血再灌注损伤(I/R)模型。通过对实验模型灌注中药方和经侧脑室移植MSCs后,应用酶联免疫吸附法和免疫组化法检测脑缺血再灌注血管新生中基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)的含量和表达,来探讨补阳还五汤及联合MSCs移植促进血管新生的分子调控机制,为中药联合干细胞移植治疗缺血性脑血管疾病的临床应用奠定理论基础。
方法：清洁级成年健康 SD 大鼠,无菌条件下取出股骨和胫骨,DMEM 培养液冲出骨髓,200 目钢网过滤。然后用密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),PBS洗两次,将沉淀物加入含10%FBS的DMEM培养液10ml,轻轻吹打,做成细胞悬液,计数,稀释,按设计密度接种于T-75培养瓶中,置于 37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度的 CO2培养箱中原代培养。待细胞铺满瓶底后用25%胰蛋白酶消化传代,取第八代冻存移植。
采用“线栓法”制作大鼠大脑中动脉栓塞模型,动物分为假手术组、模型组、补阳还五汤组(中药组)、骨髓间充质干细胞组(干细胞组)、补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞(联合组),每组 21 只。中药组、联合组自造模前 3 天开始给予补阳还五汤浓缩液15ml/kg体重灌胃,假手术组,模型组,干细胞组用等量生理盐水灌胃,每日一次,至造模后10天；干细胞组、联合组造模后在立体定位仪下用微量进样器向侧脑室注入干细胞 5μL,假手术组、模型组、中药组给予等量生理盐水。每只大鼠分别于术后 1 天、7 天、10 天三个时间点观察大鼠神经功能症状给予评分,取材。所有大鼠腹主动脉取血清,断头取脑,取大脑嗅球后6至11mm的脑组织,用酶联免疫吸附法测定外周血 MMP-9 的含量,用免疫组化法测定大脑组织中MMP表达水平,计数CD34表达来反应血管新生情况。
结果：1.补阳还五汤联合MSCs对大鼠脑缺血后神经功能症状的影响模型组各时间点神经症状评分均较假手术组增高(P<0.01)；用药组个时间点神经症状评分均较相应时间模型组降低(P<0.05)；联合组神经症状评分较中药组、干细胞组降低(P<0.05)。
2.HE染色结果 假手术组神经细胞结构形态正常,核呈圆形或者椭圆形,核仁明显,胞浆无红染,无细胞及间质水肿；模型组见大量神经细胞变性、坏死、胞体皱缩,核固缩、碎裂、溶解,胞浆浓缩红染,间质水肿明显,炎症细胞浸润；联合组神经变性、坏死数量减少,程度减轻。
3.大鼠脑缺血用药后各组中MMP-9的含量及MMP-9的表达假手术组中MMP-9含量极低,几乎不表达；中药组、干细胞组、联合组与假手术组相比,含量和数目明显增多,尤其以联合组表达最强。与模型组相比,中药组、干细胞组、联合组MMP-9表达均增强(P<0.05,P<0.01)；各组7天较1天、10天MMP-9表达增强(P<0.05)。
结论：1. 采用密度梯度离心法能够去除骨髓中的绝大多数红细胞、脂肪细胞和血小板,分离获取单核细胞,经原代培养和不断的传代获取纯度较高的MSCs。
2. 应用药物分析化学的方法对益气活血汤药分别提取芳香水,减压浓缩制备。方法更先进,有效成分不易丢失,提高了药物的生物利用度,更有利于吸收；降低了灌胃量,不适反应大大减少。
3.短暂性脑缺血再灌注损伤动物模型的制备采用改良线栓法取得了较好效果,神经行为学评分理想,症状很接近人表现。其简便、易行,容易操作,很具有实用性,是制作脑缺血再灌注损伤动物模型理想的方法。
4. 补阳还五汤联合MSCs在脑缺血再灌注损伤中通过促进血管新生影响因子 MMP-9 能明显改善大鼠的神经功能,MMP-9 高含量和高表达,降解细胞外基质,影响血管新生的一系列因子,从而促进血管新生,使其在保护病灶、促进增殖、血管新生方面发挥作用。