背景白内障是是目前在世界范围内致盲和视力残疾的主要因素,也是我国老年人群致盲的首要原因,我国约有250万人因白内障致盲,随着我国人口老龄化进程逐步加快,预计2020年我国白内障盲人数将达506.25万。研究老年性白内障的发病机制、预防白内障发生或延缓其发展的途径己成为一项全球性的社会和经济问题。晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性的细胞,能分裂分化出晶状体纤维细胞、产生晶状体蛋白,对维持晶状体内环境的稳定,保持晶状体的渗透压、抵抗外来有害因子的损伤起重要作用。晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础。氧化应激是外界各种致白内障因素作用的主要途径。氧化应激反应通过引起晶状体上皮细胞膜通透性改变、蛋白质构象改变、DNA损伤等导致细胞凋亡,从而形成晶状体混浊。在众多氧化应激产物中H202是最重要的物质之一。白内障患者的晶状体及房水中H202浓度约为正常人的30倍。H202通过激活多条细胞内经典信号通路引起细胞发生凋亡。目前H202诱导的晶状体上皮细胞凋亡己成为白内障形成的细胞模型被广泛研究。表观遗传学(epiginetics)是研究不涉及DNA序列变化的、可遗传的基因表达的改变,其调节机制主要包括DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histone modification)、非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)作用等。miRNA是目前研究最多的非编码RNA。miRNA是长约21～25nt的单链RNA,在转录后水平调节基因表达,一个miRNA可调控多个基因的表达,一个基因的表达可受多个miRNA的调控。miR-34a是与衰老、凋亡相关的miRNA,其主要功能是促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。miR-34a通过被p53激活,抑制E2F3、Bcl2、c-myc、CDK4、CDK6、 CyclinD1以及Cyclin E2等基因的表达,使细胞停滞在G1期,抑制细胞生长,促进细胞调亡,并通过E2F3、SIRT1与p53形成正反馈环路,不断增强其自身和p53的作用。miR-34a表达上升会引起血管内皮细胞和心肌细胞的凋亡,参与动脉粥样硬化和心肌梗死的发病机制。miR-34a在肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中均表达下调,通过导入miR-34a mimics或其前体补偿缺失的miR-34a功能在体内、外可以阻滞肿瘤细胞的生长,诱导其凋亡且对正常组织和细胞没有明显的毒副作用,miR-34a替代治疗有可能用于肿瘤的临床治疗。miR-34a可通过多种靶基因调控细胞凋亡与衰老。Bcl-2是一种重要的抗凋亡基因,Bcl-2可通过抑制线粒体通透性的改变、阻断Ca2+从内质网释放等途径阻断细胞凋亡。沉默信息调节因子SIRT1是哺乳动物中重要的NAD依赖性的去乙酰化酶,能使p53去乙酰化,调控依赖p53的过程,参与细胞衰老、凋亡、肿瘤发生等多种生理病理过程。研究发现,在乳腺癌细胞中miR-34a可通过调控靶基因bcl-2及SIRT1来调节细胞的增殖与凋亡,目前在晶状体上皮细胞中尚未见其报道。研究发现,白内障患者晶状体内的miR-34a表达升高,且与晶状体混浊程度呈正相关,提示miR-34a可能在老年性白内障发病机制中起着重要作用,白内障的发生可能与miR-34a的异常表达有关。但其具体作用机制尚未明确,miR-34a是通过调节哪些靶基因的表达引起晶状体上皮细胞衰老凋亡等问题有待深入研究。目的本研究首先以H2O2诱导人晶状体上皮细胞株]HLE-B3凋亡,再检测miR-34a表达情况,探讨在氧化应激过程中人晶状体上皮细胞miR-34a的表达水平,旨在从表观遗传学角度揭示白内障发病机理,为白内障治疗寻找新的思路。进一步采用慢病毒转染的方法构建高表达miR-34a的人晶状体上皮细胞株HLE-B3,再检测细胞凋亡和衰老情况,并在mRNA和蛋白水平检测bcl-2和SIRT1的表达情况,探讨miR-34a的生物学功能及其对bcl-2、SIRT1的调控作用,为以miR-34a及相关分子为靶点的白内障靶向治疗提供实验依据。方法1.晶状体上皮细胞培养与处理人晶状体上皮细胞(HLE-B3)细胞株,购自美国ATCC。细胞用含有10%FBS的低糖DMEM培养基培养,于37℃、体积分数5%的CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。细胞达到80%-90%融合后,用H2O2浓度为200μM的低糖DMEM处理24h。2.构建和验证过表达miR-34a的人晶状体上皮细胞模型构建携带miR-34a的慢病毒载体,用慢病毒包装系统共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,用以感染人晶状体上皮细胞,采用嘌呤霉素进行筛选,细胞提取RNA进行qRT-PCR检测。3.流式细胞术检测细胞凋亡收集细胞,采用ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit (SouthernBiotech, USA)进行染色,流式细胞仪检测。4.衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老细胞接种于6孔板,采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天,杭州)对细胞进行固定和染色,普通光学显微镜下观察染色结果并进行衰老细胞计数,衰老细胞镜下呈深蓝色着染。5. qRT-PCR检测细胞内bcl-2、SIRT1 mRNA的表达提取细胞总RNA,采用cDNA Synthesis System 1试剂盒进行逆转录,按照SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒说明在ABI PRISM(?) 7500 Sequence Detection System定量PCR仪进行荧光定量PCR6.western blot检测细胞内bcl-2、SIRT1蛋白的表达收集细胞,提取总蛋白,取10μl蛋白上样于聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；转移样品蛋白于PVDF膜上,5%BSA室温封闭1h,一抗4°C孵育过夜；TBST洗膜3次,二抗室温孵育2h; TBST洗膜3次后,浸入增强化学发光试剂,暗室X线片压片曝光,洗片。图片经光密度图像扫描仪扫描,Flour Chem程序测定条带光密度值。7.统计学分析所有数据以均数±标准差表示,符合正态分布且方差齐者采用两个独立样本t检验,方差不齐采用t’检验,重复测量资料采用重复测量方差分析,用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,以P<0.05为有统计学意义。结果1.H2O2诱导晶状体上皮细胞调亡H2O2处理细胞后,死亡细胞不再贴壁,悬浮于培养基中,失去固有形态,呈圆形,折光性明显最高。存余的贴壁细胞变得稀疏,细胞皱缩、轮廓增强、边缘僵硬,细胞核与细胞浆界限不明显。在H2O2组和对照组细胞凋亡率分别是15.17±0.70%和6.24±0.55%,差异有统计学意义(P<0.01),H2O2组晶状体上皮细胞的凋亡率高于对照组,成功构建研究白内障的细胞模型。2.H2O2促使晶状体上皮细胞miR-34a表达水平升高H202组和对照组miR-34a相对表达量分别为2.76±0.41、1.00±0.25,与对照组相比,H2O2组miR-34a表达升高,差异有统计学意义(n=3,P<0.01)。3.慢病毒介导过表达miR-34a稳定细胞株构建及阳性细胞筛选慢病毒成功感染的细胞表达红色荧光蛋白,在倒置荧光显微镜下观察,细胞可见红色荧光。miR-34a组和空载体组中miR-34a相对表达量分别为18.69±3.71、1.00±0.02。与空载体组相比,miR-34a组中miR-34a滚达量明显升高(n=3,P(0.01),成功构建过表达miR-34a的人晶状体上皮细胞株。4. miR-34a可促进人晶状体上皮细胞凋亡miR-34a组和空载体组细胞凋亡率分别为27.83±0.20%、10.64±0.15%,miR-34a组细胞凋亡率高于空载体组,差异有统计学意义(n=3,P(0.01)。5. miR-34a可促进人晶状体上皮细胞衰老衰老的细胞SA-β-gal染色阳性,miR-34a组和空载体组SA-P-gal染色阳性率分别为87.67±4.51%、7.33±3.21%,miR-34a组中SA-β-gal染色阳性率高于空载体组,差异有统计学意义(n=3,P<0.05)。6. miR-34a可在mRNA和蛋白水平下调Bcl-2和SIRT1的表达miR-34a组和空载体组Bcl-2 mRNA相对表达量分别为0.18±0.02、1.00±0.25,与空载体组相比,miR-34a组中miR-34a表达下降,n=3,P<0.01。miR-34a组和空载体组SIRT1 mRNA相对表达量分别为0.21±0.00、1.00±0.16,miR-34a组中SIRT1表达量显著低于空载体组,n=3,P<0.01。miR-34a组和空载体组Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.31±0.00、0.57±0.00,与空载体组相比,miR-34a组中Bcl-2蛋白表达下降,n=3,P<0.01。miR-34a组和空载体组SIRT1蛋白相对表达量分别为0.03±0.00、0.19±0.00,miR-34a组中SIRT1表达量显著低于空载体组,n=3,P<0.01。结论1.miR-34a在H202诱导人晶状体上皮细胞凋亡过程中表达升高。H202促进人晶状体上皮细胞凋亡,同时也引起miR-34表达上调。miR-34a在氧化应激引起人晶状体上皮细胞凋亡的过程中扮演着重要角色,为白内障的表观遗传学研究提供新线索。2. miR-34a可通过下调BCL-2、SIRT1的表达来促进人晶状体上皮细胞的衰老和凋亡。过表达miR-34a可在mRNA和蛋白水平抑制其靶基因BCL-2、SIRT1的表达,促进人晶状体水平细胞衰老和凋亡。miR-34a可能通过引起晶状体上皮细胞凋亡的途径在老年性白内障的发病机制中起着重要作用,其有可能成为白内障防治的新靶点。