牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究

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本文通过MDBK细胞增殖BVDV,收获病毒细胞培养物,利用PEG法和蔗糖密度梯度离心法,浓缩、纯化病毒,得到纯度较高的病毒。用纯化BVDV接种家兔的方法扩增病毒,结果表明,家兔接毒后,不产生定型热,且病毒毒力减弱。 用纯化BVDV分别免疫家兔和蛋鸡,制备出琼扩效价为1:32以上的兔抗BVDV高免血清与ELISA效价为1:6400的抗BVDV卵黄抗体,并分别得出这两种抗体消长的规律。复苏本实验室研制并保存的8株分泌抗BVDV单抗隆抗体杂交瘤细胞株,按常规方法制备单抗腹水。经间接ELISA检测,结果除一株(5F11)杂交瘤细胞株抗体滴度下降明显外,其余7株无明显变化,均能稳定分泌抗体。 通过对抗原捕获ELISA反应条件的优化,确定了各组分的最佳工作条件,并在此基础上组装成两套检测试剂盒。通过试验确定,BBI公司生产的酶标板(变异系数为4.3%)为试剂盒所用酶标板;兔抗BVDV高免血清、抗BVDV卵黄抗体最佳包被浓度分别为1:1000和1:50;待测血清样品稀释浓度为1:20;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。组装成了两套试剂盒,经试验,两套检测试剂盒的检测灵敏度均达到274ng/mL,其敏感性是AGP的100倍,与AGP阳性符合率是100%;与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应,但与猪瘟病毒存在交叉反应;通过引入质控血清进行质控检验,两种检测试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。经稳定性、重复性试验,试剂盒①批间和批内的变异系数分别为8.37%和4.31%;试剂盒②批间和批内的变异系数分别为8.94%和4.75%。试剂盒保存于4℃1个月,仍能保持检测结果稳定。 试验结果表明:标准化的抗原捕获ELISA试剂盒具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国BVDV监测提供了行之有效的技术手段,为试剂盒的商品化奠定了基础。
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