论文部分内容阅读
背景：常染色体显性遗传小脑型共济失调(autosomal dominant cerebellar ataxias, ADCAs)是一组以共济失调为主要表现的、具有明显的临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病,病变的主要部位在脊髓、小脑和脑干,故又称脊髓小脑型共济失调(spinocerebellar ataxias, SCAs).根据neuromuscular website (http://neuromuscular.wustl.edu/ataxia/dom-atax.html)截止到2012年4月11日发布的信息,迄今为止至少己定位了SCAs33种基因型,其中19个疾病基因已被克隆。脊髓小脑型共济失调3型(spinocerebellar ataxia type3, SCA3),又名马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease, MJD),属于ADCA1型,现己证实是SCAs中最常见的亚型,在中国约占SCAs的62.09%。SCA3/MJD致病基因—MJD1基因编码区的3’端含有一段CAG三核苷酸重复序列,其异常扩增后编码形成多聚谷氨酰胺(polyglutamine, PolyQ)链。正常人CAG重复次数约12-40次,而SCA3/MJD患者可达51-86次,且CAG异常重复次数越多,发病年龄越早,症状越严重。迄今为止已发现九种神经退行性疾病是因致病基因开放阅读(open reading frame, ORF)中CAG三核苷酸重复扩展突变所致,包括SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA17、亨廷顿舞蹈病(huntington disease, HD)、脊髓延髓肌肉萎缩症(spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(denta-torubral-pallidoluysian atrophy, DRPLA),该类疾病统称为多聚谷氨酰胺(polyglutamine, polyQ)疾病。目前有关polyQ疾病的发病机制仍未完全阐明,临床上尚缺乏有效的治疗泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)和自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway)是细胞内蛋白降解的两大通路。这两条通路在降解错误折叠和易聚集蛋白方面起关键作用,尤其是自噬溶酶体途径在HD等神经变性疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。自噬途径在降解清除细胞自身大分子蛋白复合物和衰老细胞器,维持细胞内环境稳定的过程中起着非常重要的作用,同时也是细胞适应外界环境变化的一种重要机制。目前研究提示,自噬途径参与降解阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺疾病(HD、SCA3、DRPLA等)、帕金森病等多种神经系统变性疾病相关的致病蛋白并参与其病理及发病过程。Mizushima及其同事最近的研究强调了自噬与神经变性病之间联系紧密,因为通过条件性的敲除小鼠脑内的自噬基因(Atg5或Atg7)后,基础水平自噬的丧失导致了神经变性的表型和蛋白聚集体的形成。故自噬可能对细胞中的生理性及病理性的错误折叠蛋白的正常清除均起着关键作用。上调自噬水平加强聚集体蛋白的清除可能是神经系统变性病的一种治疗策略。参与调节自噬途径的信号分子种类繁多,其具体调节机制仍不清楚。现已证实的是mTOR(mammalian target of rapamycin)和IP3是自噬信号转导途径的负性调节因子。自噬的诱导剂可能成为HD以及其他有异常蛋白聚集的神经变性疾病新的治疗靶点。自噬的诱导剂分为：①依赖mTOR的自噬诱导剂：雷帕霉素可以通过抑制自噬的负性调节位点mTOR而激活自噬；②非依赖mTOR的自噬诱导剂：细胞内的肌醇三磷酸(IP3)水平对自噬具有负性调节作用,用于治疗双向情感障碍的锂盐可以抑制肌醇单磷酸酶(IMPase),降低肌醇和IP3水平而诱导自噬。在HD的细胞和果蝇模型中也证实锂盐可以减少突变Htt蛋白的聚集和毒性。PolyQ错误折叠蛋白的清除障碍是PolyQ疾病发病的主要环节。国内外不少学者已经证实锂剂能够上调自噬,加强对PolyQ易聚集蛋白的清除,抑制PolyQ蛋白的毒性作用,缓解AD、PD、HD及DRPLA等神经系统变性疾病的病情,延缓疾病进展。然而对于同样属于polyQ疾病的SCA3/MJD疾病,也可运用锂剂进行治疗,国内外关于此方面的报道少见。锂剂(Lithium)已在临床上应用多年,主要用于治疗双向情感障碍疾病,可透过血脑屏障。锂剂可能通过非依赖mTOR通路上调自噬,降解神经变性疾病中异常聚集蛋白；或者通过抑制糖原合成激酶3β(GSK-3β),导致p-catenin蛋白的上调,调控Wnt信号通路等,从而发挥抗凋亡作用。故我们选用锂剂来进行SCA3/MJD转基因果蝇模型的治疗研究。目的：探讨锂剂对SCA3/MJD转基因果蝇模型的保护作用及其机制,为临床上运用锂剂治疗SCA3/MJD提供科学的理论依据。方法：1.利用GAL4/UAS系统构建在复眼及神经系统表达致病蛋白的SCA3/MJD转基因果蝇模型。2.利用光学显微镜和扫描电镜观察氯化锂对SCA3/MJD转基因果蝇模型复眼及视网膜光感受神经元数量的影响。3.通过表型研究,了解氯化锂对SCA3/MJD转基因果蝇模型爬行能力及寿命的影响。4.利用双平衡系果蝇和GAL4/UAS系统构建在果蝇复眼共表达MJDtr-Q78蛋白和Sgg蛋白的转基因果蝇模型。5.利用双平衡系果蝇和GAL4/UAS系统构建在果蝇复眼共表达MJDtr-Q78蛋白和Sgg. S9E蛋白的转基因果蝇模型。6.利用光学显微镜和扫描电镜分别观察Sgg蛋白和Sgg. S9E蛋白的纯合和杂合表达对SCA3/MJD转基因果蝇模型复眼的影响。结果：1.利用GAL4/UAS系统构建了在果蝇复眼和神经系统中强表达MJDtr-Q78蛋白的SCA3/MJD转基因果蝇模型。该模型较好的模拟了神经退行性疾病的发展模式,表现为进展性的复眼色素脱失、结构破坏,爬行能力下降及寿命缩短。2.氯化锂干预SCA3/MJD转基因果蝇模型后,其复眼色素脱失及结构破坏好转,且在一定范围内(5-20mM)随着氯化锂剂量的增大,果蝇复眼改善渐趋明显。3.氯化锂干预SCA3/MJD转基因果蝇模型后,其爬行能力得到一定程度的改善(p<O.05),且氯化锂剂量为10mM到15mM时爬行能力改善最明显。4.一定剂量的氯化锂(5-15mM)能延长SCA3/MJD转基因果蝇模型的寿命(p<0.01),而当氯化锂剂量过大(20mM)时反而会缩短野生型果蝇的寿命,50mM的氯化锂可将亲代果蝇直接致死。5.利用双平衡系果蝇和GAL4/UAS系统分别构建了在果蝇复眼共表达MJDtr-Q78蛋白和Sgg蛋白以及MJDtr-Q78蛋白和Sgg. S9E蛋白的转基因果蝇模型。6.Sgg蛋白纯合和杂合表达均对SCA3/MJD转基因果蝇模型产生毒害作用,导致其复眼表型进一步加重。7. Sgg. S9E蛋白的纯合表达可对SCA3/MJD转基因果蝇模型产生保护作用,减轻其复眼色素脱失及坏死,缓解其复眼表型。结论：1.成功构建了在果蝇复眼和神经系统强表达MJDtr-Q78蛋白的SCA3/MJD转基因果蝇模型,证实扩展突变型polyQ蛋白对SCA3/MJD转基因果蝇模型具有毒害作用。2.发现一定剂量的氯化锂能减轻SCA3/MJD转基因果蝇模型的复眼结构破坏、光感受神经元的变性缺失,改善SCA3/MJD转基因果蝇模型的爬行能力并延长其寿命。即一定剂量的氯化锂在一定程度上具有保护SCA3/MJD转基因果蝇模型的作用。3.氯化锂可能通过抑制Sgg蛋白(GSK-3β在果蝇体内的同源蛋白)的活化而发挥保护作用。