【摘 要】
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D-1,2,4-丁三醇（BT）为一种四碳多元醇,普遍应用于军事和医药等领域。为进一步优化生物法一步合成BT的合成代谢途径,通过对葡萄糖代谢途径（EMP途径）改造,强化供应NADPH有效促进了BT的合成。敲除EMP途径关键基因pgi后,结果显示pgi基因缺失菌株MJ135kp G胞内NADPH/NADP+增加了25%。摇瓶发酵结果显示NADPH/NADP+的增加也促进了BT的合成,BT产量由未调控N
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D-1,2,4-丁三醇（BT）为一种四碳多元醇,普遍应用于军事和医药等领域。为进一步优化生物法一步合成BT的合成代谢途径,通过对葡萄糖代谢途径（EMP途径）改造,强化供应NADPH有效促进了BT的合成。敲除EMP途径关键基因pgi后,结果显示pgi基因缺失菌株MJ135kp G胞内NADPH/NADP+增加了25%。摇瓶发酵结果显示NADPH/NADP+的增加也促进了BT的合成,BT产量由未调控NADPH时的3.35 g/L提高到4.02 g/L。初始葡萄糖浓度2 g/L,24 h时补加葡萄糖4 g/L,BT合成量增加到4.13 g/L。强化NADPH供应是一个提高BT合成的有效策略。并通过荧光强度与BT的关系,观察活菌数,BT含量,荧光强度,NADPH含量变化。可以看出菌体在0-24 h活菌数,荧光强度,NADPH含量逐渐增加,24 h达到最大值,24 h之后逐渐降低,可以根据变化规律调控加糖方式,最终确定在24 h时添加葡萄糖效果最好,使菌体更好生长,更好生产BT。BT生物合成途径中各个基因的表达水平对菌株的生长状况有着重要的影响,同时也关系到整个合成途径的合成效率。RBS的特征也对于翻译起始速率有很大的影响,从而影响基因表达水平。翻译启动是翻译的主要步骤之一,在确定整体翻译率方面发挥着重要作用。起始速率对于合成生物学特别有意义,因为它提供了通过改变m RNA起始速率的来调节蛋白质表达,RBS强度的优化对基因表达水平的也有影响,通过网站设计和计算,改变某个基因前的RBS序列强度,并将NADPH传感器的应用于体内分析大肠杆菌NADPH浓度的荧光强度,进一步研究RBS的翻译效率对于NADPH含量变化和BT产量的影响。通过mdl C单个基因优化前99 bp和全基因优化对NADPH含量变化和BT合成途径进行优化,并通过梯度改变mdl C RBS强度方式来对NADPH含量变化和BT合成效率的影响,构建能高效合成BT的菌株。最终得出MJ135kp G-MQ-m3为最佳菌株,最终产量为4.84 g/L。
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