【摘 要】
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目的构建肺炎链球菌ciaR基因敲除(ΔciaR)突变株，了解该菌二元信号传导系统CiaH/CiaR中反应调节蛋白CiaR对青霉素结合蛋白基因(pbps)和cia-依赖小RNA基因(csRNAs)表达的作用。方法采用电泳迁移率试验(ESMA)确定与重组表达CiaR蛋白(rCiaR)结合的pbps基因。构建用于敲除肺炎链球菌ciaR基因的自杀质粒pEVP3ciaR，通过自杀质粒同源重组、插入失活及氯霉
【机 构】
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310053 杭州医学院；325035 温州医科大学检验医学院,310053 杭州医学院；325035 温州医科大学检验医学院,325035 温州医科大学检验医学院,310058 杭州，浙江大学医学院
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目的构建肺炎链球菌ciaR基因敲除(ΔciaR)突变株，了解该菌二元信号传导系统CiaH/CiaR中反应调节蛋白CiaR对青霉素结合蛋白基因(pbps)和cia-依赖小RNA基因(csRNAs)表达的作用。
方法采用电泳迁移率试验(ESMA)确定与重组表达CiaR蛋白(rCiaR)结合的pbps基因。构建用于敲除肺炎链球菌ciaR基因的自杀质粒pEVP3ciaR，通过自杀质粒同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得ΔciaR突变株。采用PCR及测序鉴定ΔciaR突变株。采用E-test测定青霉素(PCN)和头孢噻肟(CTX)对肺炎链球菌菌株最低抑菌浓度(MIC)。采用实时荧光定量RT-PCR，检测ΔciaR突变株及其野生株1/4 MIC PCN或CTX作用前后pbps-mRNAs和csRNAs水平变化与差异。
结果CiaR能与肺炎链球菌pbp1a、pbp1b和pbp2b基因启动子区结合。PCR和测序结果证实ΔciaR突变株中ciaR基因被插入失活。1/4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ΔciaR突变株pbps-mRNAs水平明显升高(P<0.05)、csRNAs水平明显降低(P<0.05)，但其野生株pbps-mRNAs水平明显降低(P<0.05)、csRNAs水平明显升高(P<0.05)。E-test结果显示，PCN和CTX对ΔciaR突变株MIC均较野生株增加250倍。
结论肺炎链球菌CiaR可通过下调PBP1a、PBP1b和PBP2b表达或上调csRNAs表达抑制PBPs表达，使该菌对PCN和CTX耐药性增强。
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