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中图分类号：S828 文献标识码：C 文章编号：1001-0769（2016）06-0051-02
集约化畜牧生产体系具有确切的经济效益，但也产生诸多负面影响，尤其是恶臭和畜禽废弃物处理。臭味产生受到猪舍类型和粪便处理系统的影响，大多数猪舍都为开放式通风（占总猪舍的76 %）和漏缝地板系统（占全部粪便处理系统的52 %），猪粪和污染地面不断释放出恶臭气味。
恶臭气味主要是由猪胃肠道和粪便饲料残渣、内源生成物及死亡肠道细菌通过厌氧菌发酵产生。有230多种成分会产生恶臭，主要分为4类：1）含硫化合物，2）酚和吲哚化合物，3）挥发性脂肪酸，4）氨和胺类，可通过测定恶臭化合物的浓度和气味活性值（OAV）得出的臭气强度进行归类。碳水化合物分解代谢为短链脂肪酸（SCFA）、CO2、H2和CH4，蛋白质则可代谢为短链脂肪酸、支链脂肪酸（BCFA）、酚、吲哚、硫、氨和胺，因此恶臭化合物主要是通过蛋白质降解过程产生，大量日粮蛋白进入到胃肠道中（大约每天12 g～18 g），肠上皮细胞、酶和死细菌等内源性蛋白源也会导致恶臭化合物形成。摄入的氮大约有70 %排出体外，为细菌发酵提供营养来源，并导致恶臭化合物生成。
猪的胃肠道和粪便中存在数千种细菌。其中拟杆菌、梭菌、丙酸菌、梭杆菌、链球菌和乳杆菌在蛋白质代谢调节中发挥作用，这些细菌及其代谢产物对日粮蛋白的精确影响机制仍不清楚。焦磷酸测序等新型分子技术对确定猪粪微生物菌群特征非常有效。本研究应用这些技术分析不同日粮粗蛋白水平对猪粪恶臭化合物浓度的影响，以及猪粪中恶臭化合物与菌群之间的相互关系。
1 材料与方法
1.1 试验设计、动物与日粮
动物试验方案得到了国家动物科学研究所动物关爱和使用委员会的审核和批准。试验对生长猪饲喂不同水平粗蛋白（20 %、17.5 %、15 %，饲料营养成分见表1）后粪便恶臭化合物组成和菌群情况进行研究。48头公猪【（长×大）×杜洛克】随机分为3个粗蛋白水平组，每个处理4窝，每窝4头，平均初重（BW）为45 kg。每窝均在猪舍漏缝地板下设置独立的储粪坑。通过室内温度和湿度自动控制器调节猪舍通风速度，猪舍平均温度和相对湿度分别保持在20 ℃～25 ℃和60 %。饲料喂食量为体重的5 %，每天饲喂2次。试验前有10 d的适应期，开始集粪前清洗储粪坑。
1.2 粪便收集与恶臭化合物分析
粪便收集：本研究所有处理组的样品采集均在相同条件下进行。试验为期1个月，每周分别采集各窝粪便样品，并储存于冰箱中（-20 ℃）。气相色谱法（GC）测定挥发性脂肪酸、酚和吲哚等恶臭化合物含量。
挥发性脂肪酸：5 mL粪便样品与1 mL 25 %的偏磷酸溶液及0.05 mL饱和氯化汞溶液混合，置于15 mL试管中。混合溶液在4 000 rpm、20 ℃下离心20 min，取1 mL上清液转移至1.5 mL试管。然后将上清液在12 000 rpm下离心10 min，并通过0.2 μm的过滤器。滤液转移至2.0 mL GC小瓶，气相色谱法（6890N，HP-INNOWax柱，FID检测器）分析挥发性气体浓度。温度设定：80 ℃ 2 min， 20 ℃/ min的速度升温至120 ℃，10 ℃/min升温至205 ℃，保持2 min。进样口和检测口的温度保持在250 ℃。进样量为0.2 μL，分流比10∶1。
酚和吲哚：粪便样品在20 ℃、4 000 rpm下离心20 min。取4 mL上清液，与4 mL氯仿和60 μL 4 M氢氧化钠溶液混合，置于20 mL玻璃小瓶中。混合溶液在20 ℃、4 000 rpm下离心20 min，将氯仿层移至2.0 mL GC小瓶中，气相色谱法（6890N， DB～1柱，FID检测器）分析酚类和吲哚类化合物。柱温温度设定：40 ℃保持5 min， 20 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持2 min。进样口和检测口的温度保持在250 ℃。进样量为2.0 μL，分流比5∶1。
1.3 菌群分析
用于bar-coded焦磷酸测序的PCR扩增：按制造商说明使用快速DNA提取试剂盒从粪便样品中提取总基因组DNA。使用Power-Clean DNA抑制因子去除试剂盒除去腐殖酸等干扰成分。使用引物组扩增含V1～V3可变区、大约500 bp～700 bp的细菌16S rRNA基因。PCR扩增条件是开始95 ℃ 5 min预变性，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s及72 ℃ 30 s，循环30次，最后72 ℃ 7 min循环1次。
焦磷酸测序和数据分析：使用454 FLX高通量测序系统进行焦磷酸测序。使用EzTaxon-e 数据库、强大的全球成对测序比对及BLASTN搜索工具（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/BLASTN）进行细菌高质量reads的分类分配。未能与EzTaxon-e数据库匹配的序列（>97 %）进行二次处理，使用UCHIME程序检查嵌合序列。使用CD～HIT程序在97 %相似度水平生成操作分类单元（OTU）。采用Mothur程序包计算香农多样性指数、Chao1丰度指数和Goods库覆盖率。
2 统计分析
使用SAS一般线性模型过程对恶臭化合物数据进行完全随机化设计方差分析。使用邓肯氏多重比较进行差异显著性分析，Pearson相关系数进行恶臭化合物浓度和细菌种类丰度关系分析。所有测定变量的显著性水平为P<0.05。
未完待续
原题名：Effect of Dietary Protein Levels on Composition of Odorous Compounds and Bacterial Ecology in Pig Manure （英文）
原作者： Sungback Cho（韩国农村发展局国家动物科学研究所）
集约化畜牧生产体系具有确切的经济效益，但也产生诸多负面影响，尤其是恶臭和畜禽废弃物处理。臭味产生受到猪舍类型和粪便处理系统的影响，大多数猪舍都为开放式通风（占总猪舍的76 %）和漏缝地板系统（占全部粪便处理系统的52 %），猪粪和污染地面不断释放出恶臭气味。
恶臭气味主要是由猪胃肠道和粪便饲料残渣、内源生成物及死亡肠道细菌通过厌氧菌发酵产生。有230多种成分会产生恶臭，主要分为4类：1）含硫化合物，2）酚和吲哚化合物，3）挥发性脂肪酸，4）氨和胺类，可通过测定恶臭化合物的浓度和气味活性值（OAV）得出的臭气强度进行归类。碳水化合物分解代谢为短链脂肪酸（SCFA）、CO2、H2和CH4，蛋白质则可代谢为短链脂肪酸、支链脂肪酸（BCFA）、酚、吲哚、硫、氨和胺，因此恶臭化合物主要是通过蛋白质降解过程产生，大量日粮蛋白进入到胃肠道中（大约每天12 g～18 g），肠上皮细胞、酶和死细菌等内源性蛋白源也会导致恶臭化合物形成。摄入的氮大约有70 %排出体外，为细菌发酵提供营养来源，并导致恶臭化合物生成。
猪的胃肠道和粪便中存在数千种细菌。其中拟杆菌、梭菌、丙酸菌、梭杆菌、链球菌和乳杆菌在蛋白质代谢调节中发挥作用，这些细菌及其代谢产物对日粮蛋白的精确影响机制仍不清楚。焦磷酸测序等新型分子技术对确定猪粪微生物菌群特征非常有效。本研究应用这些技术分析不同日粮粗蛋白水平对猪粪恶臭化合物浓度的影响，以及猪粪中恶臭化合物与菌群之间的相互关系。
1 材料与方法
1.1 试验设计、动物与日粮
动物试验方案得到了国家动物科学研究所动物关爱和使用委员会的审核和批准。试验对生长猪饲喂不同水平粗蛋白（20 %、17.5 %、15 %，饲料营养成分见表1）后粪便恶臭化合物组成和菌群情况进行研究。48头公猪【（长×大）×杜洛克】随机分为3个粗蛋白水平组，每个处理4窝，每窝4头，平均初重（BW）为45 kg。每窝均在猪舍漏缝地板下设置独立的储粪坑。通过室内温度和湿度自动控制器调节猪舍通风速度，猪舍平均温度和相对湿度分别保持在20 ℃～25 ℃和60 %。饲料喂食量为体重的5 %，每天饲喂2次。试验前有10 d的适应期，开始集粪前清洗储粪坑。
1.2 粪便收集与恶臭化合物分析
粪便收集：本研究所有处理组的样品采集均在相同条件下进行。试验为期1个月，每周分别采集各窝粪便样品，并储存于冰箱中（-20 ℃）。气相色谱法（GC）测定挥发性脂肪酸、酚和吲哚等恶臭化合物含量。
挥发性脂肪酸：5 mL粪便样品与1 mL 25 %的偏磷酸溶液及0.05 mL饱和氯化汞溶液混合，置于15 mL试管中。混合溶液在4 000 rpm、20 ℃下离心20 min，取1 mL上清液转移至1.5 mL试管。然后将上清液在12 000 rpm下离心10 min，并通过0.2 μm的过滤器。滤液转移至2.0 mL GC小瓶，气相色谱法（6890N，HP-INNOWax柱，FID检测器）分析挥发性气体浓度。温度设定：80 ℃ 2 min， 20 ℃/ min的速度升温至120 ℃，10 ℃/min升温至205 ℃，保持2 min。进样口和检测口的温度保持在250 ℃。进样量为0.2 μL，分流比10∶1。
酚和吲哚：粪便样品在20 ℃、4 000 rpm下离心20 min。取4 mL上清液，与4 mL氯仿和60 μL 4 M氢氧化钠溶液混合，置于20 mL玻璃小瓶中。混合溶液在20 ℃、4 000 rpm下离心20 min，将氯仿层移至2.0 mL GC小瓶中，气相色谱法（6890N， DB～1柱，FID检测器）分析酚类和吲哚类化合物。柱温温度设定：40 ℃保持5 min， 20 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持2 min。进样口和检测口的温度保持在250 ℃。进样量为2.0 μL，分流比5∶1。
1.3 菌群分析
用于bar-coded焦磷酸测序的PCR扩增：按制造商说明使用快速DNA提取试剂盒从粪便样品中提取总基因组DNA。使用Power-Clean DNA抑制因子去除试剂盒除去腐殖酸等干扰成分。使用引物组扩增含V1～V3可变区、大约500 bp～700 bp的细菌16S rRNA基因。PCR扩增条件是开始95 ℃ 5 min预变性，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s及72 ℃ 30 s，循环30次，最后72 ℃ 7 min循环1次。
焦磷酸测序和数据分析：使用454 FLX高通量测序系统进行焦磷酸测序。使用EzTaxon-e 数据库、强大的全球成对测序比对及BLASTN搜索工具（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/BLASTN）进行细菌高质量reads的分类分配。未能与EzTaxon-e数据库匹配的序列（>97 %）进行二次处理，使用UCHIME程序检查嵌合序列。使用CD～HIT程序在97 %相似度水平生成操作分类单元（OTU）。采用Mothur程序包计算香农多样性指数、Chao1丰度指数和Goods库覆盖率。
2 统计分析
使用SAS一般线性模型过程对恶臭化合物数据进行完全随机化设计方差分析。使用邓肯氏多重比较进行差异显著性分析，Pearson相关系数进行恶臭化合物浓度和细菌种类丰度关系分析。所有测定变量的显著性水平为P<0.05。
未完待续
原题名：Effect of Dietary Protein Levels on Composition of Odorous Compounds and Bacterial Ecology in Pig Manure （英文）
原作者： Sungback Cho（韩国农村发展局国家动物科学研究所）