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摘 要：用移液枪准确吸取尿样本于离心管中，加入乙腈水，涡旋混合后超声。经PRiME固相萃取柱净化，用45 ℃水浴氮吹至吹干。最后用流动相溶解定容，充分涡旋混合，过膜后用UPLC-MS/MS测定。结果显示具有良好的线性关系，相关系数r=0.999 13，加标回收试验的回收率及相对标准偏差等结果满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范-食品理化检测》的要求。本方法操作简便、高效，质谱条件及流动相梯度等一系列的条件设置合理，经质谱打碎后的定性定量离子辨识度高，有比较高的响应，检出限可满足实际检测需求，验证结果具有很好的准确度和精密度，是测定猪尿液中莱克多巴胺的一种可靠方法[1]。
关键词：高效液相色谱串联质谱；猪尿液；莱克多巴胺；残留；检测法
中图分类号：S-3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2017）07-0088-03
莱克多巴胺又名舒喘灵、金莱多巴，化学成分为1-（4-羟基苯基）-2-[1-甲基-3-（4-羟基苯基）-丙氨基]-乙醇。莱克多巴胺目前是被畜牧业广泛使用的一种β-受体激动剂，也是目前最为实用的β-受体激动剂之一。莱克多巴胺可以选择性激活支气管平滑肌的β2受体，在临床上普遍用于支气管炎、哮喘的治疗[2]。21世纪初，美国批准莱克多巴胺为兽用添加剂，用于畜禽生长过程的营养再分配，加快动物肌肉生长速度，提高动物的瘦肉率，改变胴体脂肪和瘦肉比例，同时提高动物的日增重和饲料利用率，具有减脂增肉的作用，被广泛地用于畜牧业和养殖业。但在动物机体中较大的残留会严重威胁人类健康。研究表明，莱克多巴胺在肝脏等内脏器官中的残留问题较为突出，在视网膜中的蓄积也时有报道[3]。
动物性食品中药物残留正成为社会关注的热点问题，畜禽产品中瘦肉精残留尤为突出，许多国家禁止在饲料中使用瘦肉精[4]。国家有关部门也加强了管理。开展对饲料和饲料添加剂中药物残留检测是从源头上控制的有效手段。中华人民共和国农业部公告第193号都有相关规定。药物在动物体内，随着尿液产生过程的浓缩，多数大大高于血药浓度，因此，比较容易被检测到。检测猪尿液中的药物残留适用于宰前监控，可有效地预防药物残留超标的动物源性食品流入市场，对畜禽产品质量安全具有重大意义[5]。因此，建立有效的、简便的莱克多巴胺残留检测方法迫在眉睫。而本试验方法就是希望用简单的操作对猪尿样进行处理后可以进行LC-MS/MS的快速检测，且能大容量检测，并具有较好的精密度和准确度。
1 实验部分
1.1 主要仪器设备与试剂
所用仪器为：液相色谱串联质谱联用仪（4500质谱ExionLC），离心机（Sigma公司，转数大于7 000 r/min），涡旋振荡器，氮吹仪，固相萃取仪，固相萃取小柱（HLB PRiME 6cc），离心管，滤膜（津腾：0.22 μm，水系），移液枪。
主要试剂：莱克多巴胺标准物质，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），甲酸，二次蒸馏水等。
1.2 试验方法
1.2.1 试样的准备
准确移取待测尿样放置于室温，若样本浑浊，可离心或者过滤。
1.2.2 提取
用移液枪准确吸取1.00 mL尿样于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈水（80%乙腈水 0.2%甲酸 20%水），涡旋混合1 min，混合后超声5 min。
1.2.3 净化
取7 mL样液过固相萃取小柱（PRiME 6cc），保持流速在1滴/s速度，用15 mL玻璃小管收集，移出 5.5 mL至15 mL黑色带刻度离心管，再用45 ℃水浴氮吹仪氮气吹干。
1.2.4 定容
最后用1.00 mL流动相（甲酸水：甲酸0.09 水90 甲醇10）溶解定容，充分涡旋混合，过 0.22 μm有机相滤膜，上机测定[6]。
1.3 上机测定
液相色谱及质谱条件：
色谱柱：ACQUITYUPLC BEHC18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）；
柱温：40 ℃；
流动相：A（0.1%甲酸水），B（甲醇）；流动相梯度条件见表1。
流速：0.300 mL/min；
进样量：5.0 μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM）；
离子源电压：5 500 V；
辅助气温度：500 ℃；
母离子、子离子、采集时间、去簇电压、碰撞能量及出口电压，见表2。
2 结果与分析
2.1 线性试验
按方法条件设置仪器参数，在空白样本中添加一系列浓度的标准溶液（2.0 μg/L，4.0 μg/L，10.0 μg/L，30.0 μg/L，100.0 μg/L）（上机浓度），按照上述方法进行前处理，等仪器稳定后，上机检测，制出标准曲线，相关系数r=0.999 13。
2.2 方法精密度和回收率实验
以空白猪尿样本为基质，进行加标回收试验，加标浓度分别为2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、 30.0 μg/kg。将加标样本和空白样本按方法进行前处理，上机测试，结果见表3、表4、表5。
3 结论
随着国家对滥用瘦肉精行为进行严厉打击，非法应用瘦肉精的情况得到了有效的控制。经过上述实验验证，本方法用于猪尿中莱克多巴胺残留的测定，一系列浓度的标准样本溶液 2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、30.0 μg/L、100.0 μg/L的标准曲线相关系数r=0.999 13； 2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、30.0 μg/kg加标试验变异系数分别为7.22%、3.43%、2.78%，加标试验回收率范围为90.50%～106.50%。本方法的验证结果满足《GB/T 27404-2008》的要求，精密度和准确度较好，可很好地满足实际检测工作的需要。
本试验方法操作过程简便、高效，质谱及流动相梯度等一系列的条件设置合理，经质谱打碎后的定性定量离子辨识度高，响应值较高，检出限可满足检测的需求，验证结果的精密度和准确度较好，是测定动物尿液中莱克多巴胺的一种可靠方法。
参考文献：
[1] 实验室质量控制规范GB/T 27404-2008[J].食品理化检测.
[2] 陶军，肖耀明，黄忠，马玉玲.莱克多巴胺残留检测方法的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008，（6）：8-9.
[3] 邱建琴，左曉磊.畜产品中莱克多巴胺残留的快速检测[J].畜牧兽医科技信息，2010，（5）：31-33.
[4] 陈海玲，郝春莉，黄华斌，蔡尽忠，赵丽庄，峙厦.高效液相色谱——质谱法同时测定猪尿中克伦特罗和莱克多巴胺[J].理化检验.化学分册，2011，（7）：859-860.
[5] 吴银良，刘素英，刘勇军，沈建忠，王海.单吉浩-固相萃取-气相色谱-质谱法测定猪组织中沙丁胺醇残留量[J].分析化学研究报告，2006，34（1）：23-26.
关键词：高效液相色谱串联质谱；猪尿液；莱克多巴胺；残留；检测法
中图分类号：S-3 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2017）07-0088-03
莱克多巴胺又名舒喘灵、金莱多巴，化学成分为1-（4-羟基苯基）-2-[1-甲基-3-（4-羟基苯基）-丙氨基]-乙醇。莱克多巴胺目前是被畜牧业广泛使用的一种β-受体激动剂，也是目前最为实用的β-受体激动剂之一。莱克多巴胺可以选择性激活支气管平滑肌的β2受体，在临床上普遍用于支气管炎、哮喘的治疗[2]。21世纪初，美国批准莱克多巴胺为兽用添加剂，用于畜禽生长过程的营养再分配，加快动物肌肉生长速度，提高动物的瘦肉率，改变胴体脂肪和瘦肉比例，同时提高动物的日增重和饲料利用率，具有减脂增肉的作用，被广泛地用于畜牧业和养殖业。但在动物机体中较大的残留会严重威胁人类健康。研究表明，莱克多巴胺在肝脏等内脏器官中的残留问题较为突出，在视网膜中的蓄积也时有报道[3]。
动物性食品中药物残留正成为社会关注的热点问题，畜禽产品中瘦肉精残留尤为突出，许多国家禁止在饲料中使用瘦肉精[4]。国家有关部门也加强了管理。开展对饲料和饲料添加剂中药物残留检测是从源头上控制的有效手段。中华人民共和国农业部公告第193号都有相关规定。药物在动物体内，随着尿液产生过程的浓缩，多数大大高于血药浓度，因此，比较容易被检测到。检测猪尿液中的药物残留适用于宰前监控，可有效地预防药物残留超标的动物源性食品流入市场，对畜禽产品质量安全具有重大意义[5]。因此，建立有效的、简便的莱克多巴胺残留检测方法迫在眉睫。而本试验方法就是希望用简单的操作对猪尿样进行处理后可以进行LC-MS/MS的快速检测，且能大容量检测，并具有较好的精密度和准确度。
1 实验部分
1.1 主要仪器设备与试剂
所用仪器为：液相色谱串联质谱联用仪（4500质谱ExionLC），离心机（Sigma公司，转数大于7 000 r/min），涡旋振荡器，氮吹仪，固相萃取仪，固相萃取小柱（HLB PRiME 6cc），离心管，滤膜（津腾：0.22 μm，水系），移液枪。
主要试剂：莱克多巴胺标准物质，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），甲酸，二次蒸馏水等。
1.2 试验方法
1.2.1 试样的准备
准确移取待测尿样放置于室温，若样本浑浊，可离心或者过滤。
1.2.2 提取
用移液枪准确吸取1.00 mL尿样于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈水（80%乙腈水 0.2%甲酸 20%水），涡旋混合1 min，混合后超声5 min。
1.2.3 净化
取7 mL样液过固相萃取小柱（PRiME 6cc），保持流速在1滴/s速度，用15 mL玻璃小管收集，移出 5.5 mL至15 mL黑色带刻度离心管，再用45 ℃水浴氮吹仪氮气吹干。
1.2.4 定容
最后用1.00 mL流动相（甲酸水：甲酸0.09 水90 甲醇10）溶解定容，充分涡旋混合，过 0.22 μm有机相滤膜，上机测定[6]。
1.3 上机测定
液相色谱及质谱条件：
色谱柱：ACQUITYUPLC BEHC18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）；
柱温：40 ℃；
流动相：A（0.1%甲酸水），B（甲醇）；流动相梯度条件见表1。
流速：0.300 mL/min；
进样量：5.0 μL；
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM）；
离子源电压：5 500 V；
辅助气温度：500 ℃；
母离子、子离子、采集时间、去簇电压、碰撞能量及出口电压，见表2。
2 结果与分析
2.1 线性试验
按方法条件设置仪器参数，在空白样本中添加一系列浓度的标准溶液（2.0 μg/L，4.0 μg/L，10.0 μg/L，30.0 μg/L，100.0 μg/L）（上机浓度），按照上述方法进行前处理，等仪器稳定后，上机检测，制出标准曲线，相关系数r=0.999 13。
2.2 方法精密度和回收率实验
以空白猪尿样本为基质，进行加标回收试验，加标浓度分别为2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、 30.0 μg/kg。将加标样本和空白样本按方法进行前处理，上机测试，结果见表3、表4、表5。
3 结论
随着国家对滥用瘦肉精行为进行严厉打击，非法应用瘦肉精的情况得到了有效的控制。经过上述实验验证，本方法用于猪尿中莱克多巴胺残留的测定，一系列浓度的标准样本溶液 2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、30.0 μg/L、100.0 μg/L的标准曲线相关系数r=0.999 13； 2.0 μg/kg、10.0 μg/kg、30.0 μg/kg加标试验变异系数分别为7.22%、3.43%、2.78%，加标试验回收率范围为90.50%～106.50%。本方法的验证结果满足《GB/T 27404-2008》的要求，精密度和准确度较好，可很好地满足实际检测工作的需要。
本试验方法操作过程简便、高效，质谱及流动相梯度等一系列的条件设置合理，经质谱打碎后的定性定量离子辨识度高，响应值较高，检出限可满足检测的需求，验证结果的精密度和准确度较好，是测定动物尿液中莱克多巴胺的一种可靠方法。
参考文献：
[1] 实验室质量控制规范GB/T 27404-2008[J].食品理化检测.
[2] 陶军，肖耀明，黄忠，马玉玲.莱克多巴胺残留检测方法的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008，（6）：8-9.
[3] 邱建琴，左曉磊.畜产品中莱克多巴胺残留的快速检测[J].畜牧兽医科技信息，2010，（5）：31-33.
[4] 陈海玲，郝春莉，黄华斌，蔡尽忠，赵丽庄，峙厦.高效液相色谱——质谱法同时测定猪尿中克伦特罗和莱克多巴胺[J].理化检验.化学分册，2011，（7）：859-860.
[5] 吴银良，刘素英，刘勇军，沈建忠，王海.单吉浩-固相萃取-气相色谱-质谱法测定猪组织中沙丁胺醇残留量[J].分析化学研究报告，2006，34（1）：23-26.