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【摘 要】目的：利用免疫组化方法检测胃癌淋巴结微转移的敏感指标白细胞分化抗原（cluster of differentiation antigens，CD）CD44和细胞角蛋白（cytokeratin，CK） CK18，分析常规病理未发现转移灶的胃癌淋巴结是否存在胃癌微转移及其与预后的关系。方法：运用免疫组化方法检测CD44和CK18在胃癌患者淋巴结中的表达情况，并结合临床相关资料进行统计学分析。结果：26.7%患者（10.7%淋巴结）CD44阳性， 23.3%患者（9.9%淋巴结）CK18阳性；进展期胃癌淋巴结微转移的发生率明显高于早期胃癌（P﹤0.05）；存在淋巴结微转移的患者五年生存率明显低于无淋巴结微转移的患者（P﹤0.05）。结论：利用CD44和CK18因子监测胃癌微转移敏感度高，可以作为临床诊断治疗的参考因素，胃癌淋巴结微转移是影响胃癌预后的重要因素。
【关键词】胃癌；微转移；CD44 CK18
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）10—0009—02
胃癌的发病率和病死率均居我国常见恶性肿瘤前列，胃癌的复发和转移是影响胃癌患者预后的主要因素，胃癌的微转移则与术后复发和转移密切相关[1]， 因此，早期准确的监测到胃癌微转移的发生，使患者及时合理地接受综合治疗，对于够降低胃癌的复发和转移，提高患者的生存率有重要意义。
1 材料与方法
1.1一般资料 收集新乡医学院第三附属医院和新乡市中心医院病理科2003年1月至2008年1月因胃癌而行胃癌根治术，常规病理检查淋巴结阴性，30例胃癌患者的100枚组织石蜡块共242枚淋巴结。早期胃癌9例，进展期胃癌21例，所有淋巴结HE染色均没有发现癌细胞。所选取的30例病人均获满意随访结果，随访期限5～10年，其中5例病人死于术后肿瘤复发。
1.2主要方法 采用免疫组织化学染色，小鼠抗人CD44（HCAM）单克隆抗体、小鼠抗人CK18单克隆抗体试剂盒购自上海原叶科技有限公司。免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，试剂公司提供之阳性片为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。用200倍和400倍镜观察各标本染色情况。
1.3结果判定标准 免疫组化染色阳性反应为黄—棕色颗粒且明显高于背景染色。阳性染色位于细胞浆，呈弥漫性胞浆着色，但有一个强的边缘染色带。所以阳性判断标准为淋巴结中有一个或多个呈阳性染色，具有上皮形态，且形态不典型的癌细胞。两人双盲法观察切片，在低倍镜下（10×10）观察选择有代表性的区域然后再高倍镜下（10×40）随机观测10个阳性细胞较多的视野。微转移的癌细胞在淋巴结中有两种存在方式：一种以一小簇癌细胞形式存在；另一种以单个癌细胞形式存在。
1.4统计学处理 用SPSS13.0软件包进行，两种指标间的比较用配对资料的χ2检验，微转移与临床病理参数间关系用χ2检验。用Kaplan-Meier法制累计生存率曲线；Log-rank检验检测差异之间的显著性意义；多变量生存分析用Cox模型进行；P<0.05为具有显著性意义的标准。
2结果
2.1 CD44和CK18在各样本中表达情况 结果见表1，8例病人（26.7%）共26枚（10.7%）淋巴结CD44阳性细胞出现；7例病人（23.3%）共24枚（9.9%）淋巴结CK18阳性细胞出现。
2.2早期胃癌和进展期胃癌淋巴结发生微转移情况对比 CD44监测结果：早期胃癌（30%），共1例（12.5%）患者，2枚（7.7%）淋巴结发现隐匿肿瘤細胞存在；进展期胃癌（70%），共7例（87.5%）患者，24枚（92.3%）淋巴结发现有隐匿肿瘤细胞存在。CK18监测结果：早期胃癌（30%），共1例（14.2%）患者，2枚（8.33%）淋巴结发现微转移。进展期胃癌（70%），共6例（85.7%）患者，22枚（91.8%）淋巴结发现有隐匿肿瘤细胞存在。进展期胃癌淋巴结发生微转移的发生几率高于早期胃癌（P<0.05）。
2.3 CD44与CK18阳性率与临床几种病理因素关系
本研究提示胃癌微转移的发生与病人的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、Borrmann分型无明显关系（P>0.05）。CD44与CK18阳性率与临床几种病理因素关系如表2。
2.4多变量生存分析
Cox多变量生存分析回归模型显示在胃癌的各种临床病理因素中性别、年龄、部位、肿瘤大小、Borrmann分型与预后无关，而淋巴结微转移是影响胃癌预后的独立因子（P﹤0.05）。见表3。
3讨论
1993年国际抗癌联盟（UICC）在肿瘤TNM分期补充材料中指出：当微小肿瘤转移灶生长到直径在1-2mm时称为微转移。常规病理HE染色对于这些微转移的肿瘤细胞常常难以发现，免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法是目前认为灵敏度最高最常用的检测方法。Meachara[2]等采用免疫组化法检测34例早期胃癌的420枚淋巴结，结果检出23.5%（8/34）的患者存在微转移灶，可见免疫组化检测胃癌淋巴结微转移具有其优势。
CD44是一种由单一基因编码的具有高度特异的多功能跨膜蛋白，属于白细胞黏附分子，分为标准型（CD44S）和变异型（CD44V）。CD44V主要表达于癌细胞，加强癌细胞的黏附和运动能力，与转移潜能相关。有学者[6]采用免疫组化方法研究CD44与胃癌患者的预后，结果表明CD44S表达强阳性术后死亡率明显大于CD44S弱阳性的胃癌患者，说明CD44S表达与预后有关。夏建国等[7]采用免疫组化二步法对100例进展期胃癌标本进行标记，结果发现CD44V6的表达随胃癌浸润深度、周围淋巴结转移而升高，认为CD44V6在胃癌淋巴结转移中起着重要作用，可用于早期预测胃癌的转移潜能和预后。很多研究[3-5]采用不同方法证实CD44能够反映胃癌微转移的发生，因此CD44被认为是检测胃癌淋巴结微转移的一个经典指标。CK18是Ⅰ型中间丝蛋白的一种，是单层上皮细胞和腺上皮细胞的主要成分。CK18应用于多种消化道肿瘤微转移灶的检测中，而应用于胃癌微转移的报道较多，是目前检测胃癌微转移常用的灵敏指标之一。 胃癌患者的预后与多种临床因素相关，比如肿瘤的分期及分化程度，淋巴结转移情况，外科手术方式选择，术后化疗等。在多种因素的影响下，如何认识胃癌淋巴结微转移与预后的关系是一个复杂的问题，众多文献研究没有统一的观点，不同学者也有自己不同的观点。本研究采用CD44和CK18两个胃癌微转移常用的灵敏指标阐明了胃癌淋巴结微转移病人的五年生存率明显低于无淋巴结微转移胃癌病人（P﹤0.05），客观的说明胃癌淋巴结微转移的发生增加了患者复发和转移的危险性，降低了患者的生存率。随着免疫学和分子生物学的发展，胃癌淋巴结微转移的检测将更加准确，有利于对患者的预后进行准确科学的判断。
參考文献：
[1] 吴在德.外科学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2004：460.
[2] Okayama H， Kumamoto K， Saitou K， et al. CD44v6， MMP-7 and nuclear Cdx2 are significant biomarkers for prediction of lymph node metastasis in primary gastric cancer [J].Oncol Rep.2009，22（4）：745-55.
[3] Ma L， Jiang T. Clinical implications of Ezrin and CD44 co-expression in breast cancer [J]. Oncol Rep.2013，30（4）：1899-905.
[4] 代志鹏，谭静. 胃癌相关基因的研究进展[J].新乡医学院学报.2012，29（11）：881-883.
[5] 夏建国，杨力，陈国玉. CD44与胃癌淋巴结转移及预后的关系[J].江苏医药杂志 2003， 29（ 1）：66-67.
[6] Xu W， Zhang MW， Huang J， et al. Correlation between CK18 gene and gastric carcinomami crometastasis [J] .World J Gastroenterol.2005， 11（41）： 6530-6534.
[7] Liu L，Zhang Y. Limitations of detection of bone-marrow micrometastasis with or without stromal reaction in gastric carcinoma [J] .Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi.2000，29（5）：339-42.
【关键词】胃癌；微转移；CD44 CK18
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）10—0009—02
胃癌的发病率和病死率均居我国常见恶性肿瘤前列，胃癌的复发和转移是影响胃癌患者预后的主要因素，胃癌的微转移则与术后复发和转移密切相关[1]， 因此，早期准确的监测到胃癌微转移的发生，使患者及时合理地接受综合治疗，对于够降低胃癌的复发和转移，提高患者的生存率有重要意义。
1 材料与方法
1.1一般资料 收集新乡医学院第三附属医院和新乡市中心医院病理科2003年1月至2008年1月因胃癌而行胃癌根治术，常规病理检查淋巴结阴性，30例胃癌患者的100枚组织石蜡块共242枚淋巴结。早期胃癌9例，进展期胃癌21例，所有淋巴结HE染色均没有发现癌细胞。所选取的30例病人均获满意随访结果，随访期限5～10年，其中5例病人死于术后肿瘤复发。
1.2主要方法 采用免疫组织化学染色，小鼠抗人CD44（HCAM）单克隆抗体、小鼠抗人CK18单克隆抗体试剂盒购自上海原叶科技有限公司。免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，试剂公司提供之阳性片为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。用200倍和400倍镜观察各标本染色情况。
1.3结果判定标准 免疫组化染色阳性反应为黄—棕色颗粒且明显高于背景染色。阳性染色位于细胞浆，呈弥漫性胞浆着色，但有一个强的边缘染色带。所以阳性判断标准为淋巴结中有一个或多个呈阳性染色，具有上皮形态，且形态不典型的癌细胞。两人双盲法观察切片，在低倍镜下（10×10）观察选择有代表性的区域然后再高倍镜下（10×40）随机观测10个阳性细胞较多的视野。微转移的癌细胞在淋巴结中有两种存在方式：一种以一小簇癌细胞形式存在；另一种以单个癌细胞形式存在。
1.4统计学处理 用SPSS13.0软件包进行，两种指标间的比较用配对资料的χ2检验，微转移与临床病理参数间关系用χ2检验。用Kaplan-Meier法制累计生存率曲线；Log-rank检验检测差异之间的显著性意义；多变量生存分析用Cox模型进行；P<0.05为具有显著性意义的标准。
2结果
2.1 CD44和CK18在各样本中表达情况 结果见表1，8例病人（26.7%）共26枚（10.7%）淋巴结CD44阳性细胞出现；7例病人（23.3%）共24枚（9.9%）淋巴结CK18阳性细胞出现。
2.2早期胃癌和进展期胃癌淋巴结发生微转移情况对比 CD44监测结果：早期胃癌（30%），共1例（12.5%）患者，2枚（7.7%）淋巴结发现隐匿肿瘤細胞存在；进展期胃癌（70%），共7例（87.5%）患者，24枚（92.3%）淋巴结发现有隐匿肿瘤细胞存在。CK18监测结果：早期胃癌（30%），共1例（14.2%）患者，2枚（8.33%）淋巴结发现微转移。进展期胃癌（70%），共6例（85.7%）患者，22枚（91.8%）淋巴结发现有隐匿肿瘤细胞存在。进展期胃癌淋巴结发生微转移的发生几率高于早期胃癌（P<0.05）。
2.3 CD44与CK18阳性率与临床几种病理因素关系
本研究提示胃癌微转移的发生与病人的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、Borrmann分型无明显关系（P>0.05）。CD44与CK18阳性率与临床几种病理因素关系如表2。
2.4多变量生存分析
Cox多变量生存分析回归模型显示在胃癌的各种临床病理因素中性别、年龄、部位、肿瘤大小、Borrmann分型与预后无关，而淋巴结微转移是影响胃癌预后的独立因子（P﹤0.05）。见表3。
3讨论
1993年国际抗癌联盟（UICC）在肿瘤TNM分期补充材料中指出：当微小肿瘤转移灶生长到直径在1-2mm时称为微转移。常规病理HE染色对于这些微转移的肿瘤细胞常常难以发现，免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法是目前认为灵敏度最高最常用的检测方法。Meachara[2]等采用免疫组化法检测34例早期胃癌的420枚淋巴结，结果检出23.5%（8/34）的患者存在微转移灶，可见免疫组化检测胃癌淋巴结微转移具有其优势。
CD44是一种由单一基因编码的具有高度特异的多功能跨膜蛋白，属于白细胞黏附分子，分为标准型（CD44S）和变异型（CD44V）。CD44V主要表达于癌细胞，加强癌细胞的黏附和运动能力，与转移潜能相关。有学者[6]采用免疫组化方法研究CD44与胃癌患者的预后，结果表明CD44S表达强阳性术后死亡率明显大于CD44S弱阳性的胃癌患者，说明CD44S表达与预后有关。夏建国等[7]采用免疫组化二步法对100例进展期胃癌标本进行标记，结果发现CD44V6的表达随胃癌浸润深度、周围淋巴结转移而升高，认为CD44V6在胃癌淋巴结转移中起着重要作用，可用于早期预测胃癌的转移潜能和预后。很多研究[3-5]采用不同方法证实CD44能够反映胃癌微转移的发生，因此CD44被认为是检测胃癌淋巴结微转移的一个经典指标。CK18是Ⅰ型中间丝蛋白的一种，是单层上皮细胞和腺上皮细胞的主要成分。CK18应用于多种消化道肿瘤微转移灶的检测中，而应用于胃癌微转移的报道较多，是目前检测胃癌微转移常用的灵敏指标之一。 胃癌患者的预后与多种临床因素相关，比如肿瘤的分期及分化程度，淋巴结转移情况，外科手术方式选择，术后化疗等。在多种因素的影响下，如何认识胃癌淋巴结微转移与预后的关系是一个复杂的问题，众多文献研究没有统一的观点，不同学者也有自己不同的观点。本研究采用CD44和CK18两个胃癌微转移常用的灵敏指标阐明了胃癌淋巴结微转移病人的五年生存率明显低于无淋巴结微转移胃癌病人（P﹤0.05），客观的说明胃癌淋巴结微转移的发生增加了患者复发和转移的危险性，降低了患者的生存率。随着免疫学和分子生物学的发展，胃癌淋巴结微转移的检测将更加准确，有利于对患者的预后进行准确科学的判断。
參考文献：
[1] 吴在德.外科学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2004：460.
[2] Okayama H， Kumamoto K， Saitou K， et al. CD44v6， MMP-7 and nuclear Cdx2 are significant biomarkers for prediction of lymph node metastasis in primary gastric cancer [J].Oncol Rep.2009，22（4）：745-55.
[3] Ma L， Jiang T. Clinical implications of Ezrin and CD44 co-expression in breast cancer [J]. Oncol Rep.2013，30（4）：1899-905.
[4] 代志鹏，谭静. 胃癌相关基因的研究进展[J].新乡医学院学报.2012，29（11）：881-883.
[5] 夏建国，杨力，陈国玉. CD44与胃癌淋巴结转移及预后的关系[J].江苏医药杂志 2003， 29（ 1）：66-67.
[6] Xu W， Zhang MW， Huang J， et al. Correlation between CK18 gene and gastric carcinomami crometastasis [J] .World J Gastroenterol.2005， 11（41）： 6530-6534.
[7] Liu L，Zhang Y. Limitations of detection of bone-marrow micrometastasis with or without stromal reaction in gastric carcinoma [J] .Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi.2000，29（5）：339-42.