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摘要：口腔癌是一种常见的世界性的粘膜上皮性的恶性肿瘤，其主要的发生机制可能是基因的突变造成了细胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，从而导致细胞内信号传导和细胞周期紊乱，细胞凋亡受到抑制，出现细胞的异常增殖。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种新的诱导基因沉默的基因治疗技术。本文将就RNA干扰技术及其在口腔癌基因治疗的研究及应用作一综述。
关键词：RNA干扰 口腔癌 基因治疗
【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0039-02
口腔癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全身恶性肿瘤第六位，局部复发率高，预后较差，超过半数的晚期口腔癌患者生存不足1年[1]。口腔癌发生的根本原因是基因水平的变异。基因治疗（gene therapy）是运用分子生物学的技术，通过基因变换的方法达到治疗人类疾病的目的，包括转染新遗传物质和对现存遗传物质进行加工，从而使疾病在基因水平得以治疗，是一种分子生物学和现代医学相结合的新兴技术。基因治疗的疾病包括心血管疾病、感染性疾病、遗传病、恶性肿瘤。近年来RNAi技术的不断成熟，使其在医学领域迅速发展，尤其在癌症的治疗方面，已经成为基因治疗领域的研究热点，并且部分学者已经取得了重大的突破。因此，基因治疗在口腔癌的治疗和预后判断方面占了非常重要的地位。
RNAi是1998年由Fire[2]等在新杆状线虫中首次发现的一种序列特异性的基因转导后的沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。它通过一段与靶基因序列同源的双链DNA（double stranded DNA，dsDNA）裂解所产生的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）导致同源mRNA降解从而使目的基因失表达。
1 RNAi的调控机制
在不同生物物种中，RNAi作用的机制各不相同，大致可分为大于30nt（核苷酸）的非特异效应长的双链RNA和21～23nt的特异效应的短双链RNA [3，4]。肿瘤基因治疗主要是在转录、转录后、翻译等水平实现RNAi的特异性调控效应。
1.1 转录水平的调控主要通过siRNA与互补DNA直接结合发挥作用，激发同源的DNA甲基化加强，限制目的基因转录，关闭其表达，进而导致基因的沉默。但是甲基化如果出现在启动子区域，转录就不能进行，甲基化出现在编码区，则转录继续进行，但在转录后水平上实现基因沉默。
1.2 转录后水平的调控可分起始阶段和效应阶段[5]。起始阶段主要包括dsRNA的导人和切割。导入包括外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式导入dsRNA；切割则是指dsRNA在细胞内切酶（dicer）的作用下切割成2l～23 nt长度的siRNA[6]。效应阶段是指在siRNA反义链的指导下，双链siRNA与1个RNA酶结合形成沉默复合体（RNA induced si1encing complex，RISC）[7]，然后siRNA双链解螺旋，正义链释放，激活RISC，识别互补的靶mRNA，siRNA的反义链与复合体换位，并在距siRNA 3’末端的12nt处切割目的mRNA，使其丧失转录信息。
1.3 翻译水平上的调控是抑止相应mRNA的翻译，使蛋白质的表达受阻，其中小时序RNA（small temporal RNA，stRNA）起重要作用（长度约70nt的RNA形成的茎环样前体），经dicer酶作用后形成长约2l～23 nt的dsRNA，通过RISC结合在相应mRNA的3’末端非翻译区上，进而阻断mRNA的翻译。
2 RNAi技术在口腔癌中的实验研究
2.1 下调凋亡抑制基因或癌基因的表达。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase protein，hTERT）基因较高的表达于人口腔癌中，其作用机制是：hTERT高表达后合成端粒重复序列，以弥补细胞分裂过程中的端粒短缩，促进癌细胞分化、抑制凋亡发生，最终导致癌细胞永生化。刘希强、黄鸿章[8]等利用RNAi技术，构建了慢病毒重组hTERT质粒载体并导入口腔癌细胞株Tca8113及裸鼠皮下移植瘤内，发现siRNA诱导的RNAi明显抑制hTERT基因的表达，从而抑制了Tca8113细胞的增殖。S期激酶相关蛋白（S-phase kinase associated protein2，Skp2）基因是潜在的原癌基因，其表达产物Skp2蛋白不但是泛素化的必要条件，也参与P27蛋白的降解。在口腔鳞状细胞癌中P27蛋白低表达而Skp2蛋白过度表达。日本学者Kudo Y[9]通过RNAi沉默Skp2基因，发现转染的口腔癌细胞中Skp2蛋白表达减少而P27蛋白表达增加，裸鼠体内同样抑制了肿瘤的增殖，为口腔癌的基因治疗提供了可能的靶基因。
2.2 上调抑癌基因的表达。抑癌基因p27的异常与肿瘤的发生密切相关，在大部分的癌细胞中，都可以检测到p27基因表达下调。角蛋白（Creek Keratin Shampoo，CKs1）的表达与p27的下调呈反相关。Kitajimat[10]等用特异的siRNA对口腔鳞状细胞癌（舌癌和牙龈癌）细胞中的CKsl进行干扰，成功抑制了CKs1基因的表达并诱导了p27在细胞中的积累，从而抑制了口腔鳞状细胞癌细胞的生长。
2.3 抑制与信号转导相关的酶基因的表达。某些癌基因的激活会造成正常信号通路的紊乱，而影响细胞正常的繁殖凋亡，引起肿瘤。siRNA可以高效、特异地封闭这些基因的转录产物受体，却不影响其他基因的表达。梁新华[11]等通过RNAi引起尿激酶纤溶酶原激活物受体的低表达，成功抑制口腔癌细胞的增殖。
2.4 抑制耐药基因的表达。恶性肿瘤化疗失败的主要原因是耐药性，耐药基因的表达很大程度地影响化疗药物的效果。Survivin是一种凋亡抑制基因，特异性地表达于肿瘤细胞，通过抑制终末效应蛋白caspase-3和7发挥其抑制肿瘤细胞凋亡的作用。许建辉、黄洪章[12]等人用特异性siRNA干扰口腔鳞状细胞癌中Survivin的表达，抑制Tca8113细胞增殖和增加caspase-3活性，促进其凋亡，同时也提高了肿瘤细胞对放射线及化疗药物的敏感性。Bcl-2基因是另一种重要的凋亡抑制基因，其编码蛋白Bcl-2在肿瘤细胞中高表达，增强了癌细胞的存活力，拮抗化疗药物诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用，与肿瘤耐药性的形成密切相关。Yin ZH等[13]用靶向BCL-2的shRNA的载体转染鼻咽癌细胞株CNE1，抑制BCL-2蛋白的表达，影响细胞增殖的效果不明显，但癌细胞对顺铂的敏感性增强。此外，Souichi Yanamoto[16]也通过沉默的p53R2基因提高了口腔癌细胞对五氟脲嘧啶的敏感性。 2.5 抗血管生成基因治疗。口腔癌也是血管依赖性的肿瘤，肿瘤新生血管为其生长提供养分的输送及代谢物的输出。但是肿瘤血管通常缺乏平滑肌，基底膜存在不规则的漏洞，为肿瘤的转移提供可能。抗血管生成得基因治疗主要通过抑制肿瘤血管的生成，来抑制肿瘤的生长和转移。目前抗血管生成基因主要包括：针对VEGF及其受体（VEGFR）的基因、血管抑素（vasostatin）基因、内皮抑素（endostatin）基因。其中又以VEGF诱导肿瘤血管生成的作用最强、特异性最高，成为抗血管生成基因治疗的首选[14]。Shen[15]等针对VEGF各亚型的siRNA构建成RNAi表达载体，均可特异性地抑制各亚型VEGF的表达，有效地抑制了肿瘤细胞的生长。u-PAR主要参与细胞分化、血管形成、细胞迁移、细胞外基质降解和组织重建等过程。在高度恶性的口腔癌细胞OSC-19中，u-PAR是其侵袭和转移所必需的。Nozaki[16]应用u-PAR特异的siRNA转染该细胞，沉默u-PAR基因，实现抑制了OSC-19细胞的侵袭和转移。另外，HIF-1a过表达与肿瘤侵袭性的强弱密切相关，Zhang等[17]应用siRNA的方法敲除舌癌细胞株SCC-4和SCC-9的HIF-1a基因，成功抑制了SCC-4和SCC-9的增殖并且诱导了该细胞的凋亡，为用干扰HIF-1a治疗人舌鳞状细胞癌提供了理论及实验依据。
3 RNAi技术在口腔癌中的应用
目前，应用于口腔癌基因治疗的药物只有重组腺病毒介导的p53和西妥昔单抗。美国研究的重组腺病毒p53（Ad-p53）I～Ⅲ期临床试验在多个临床实验中心的近千人中进行，主要通过瘤内多点注射，少量通过静脉给药，并与放化疗联合应用。结果表明：Ad-p53瘤内注射治疗复发性头颈部鳞癌安全、有效，只有发热和注射部位疼痛是最常见的不良反应[18]。同期研究，在手术切除的晚期口腔癌患者术中给予Ad-p53治疗，术后联合放化疗，证实了手术时利用Ad-p53抑制可能残存肿瘤细胞，以及联合放化疗治疗的可行性、安全性和有效性[18]。2003年FDA认定Ad-p53可延长复发性不可手术切除的头颈部鳞状细胞癌患者生存时间，推迟疾病进展时间。
西妥昔单抗作为EGFR的单克隆抗体能够与EGFR的内源性EGF-TGF-Ⅱ竞争性地与EGFR胞外配体区结合，降低EGFR自身磷酸化，阻断下游信号转导通路，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信号的下传，抑制肿瘤细胞增殖[19]。目前，多采用全身给药（静脉滴注）的方法治疗头颈肿瘤患者的西妥昔单抗，且多与放、化疗等常规疗法联合应用。Pfister等[20，21]对20余例临床晚期患者（I和Ⅳ期）随机分为对照组和治疗组，其中对照组采用放疗（1.8Gy/d、共70Gy）和通过静脉给药顺铂（100 mg/m2），而治疗组为放疗（1.8Gy/d、共70Gy）加静脉给药西妥昔单抗（400 mg/m2）进行I期和Ⅱ期临床试验，取得了良好的治疗效果；随后的Ⅲ期试验证实，西妥昔单抗与放疗联合可显著提高患者2到3年的生存率。对于复发或转移且对顺铂类药物产生耐药性的头颈部鳞癌患者，应用西妥昔单抗后，部分患者可恢复或提高对顺铂类药物的敏感性[22]。
4 口腔癌的其他基因治疗方法
4.1 免疫基因治疗。免疫基因治疗是指结合机体自身的免疫机制将特定的外源基因转入肿瘤细胞中，并使其高水平表达相关的细胞因子或MHC抗原，从而激化特异性的抗肿瘤免疫作用。使用遗传工程技术处理肿瘤细胞，使其携带特定细胞因子基因，注射至机体后可以在肿瘤位点持续稳定的表达并释放所携带的细胞因子。注射活的携带特定细胞因子基因的肿瘤细胞，经过增殖会产生更多的抗原，提高细胞因子浓度，进而达到生物学和药理学所需的阈值，引起抗肿瘤的特异性免疫反应。随着免疫反应的进行，肿瘤细胞被杀死，从而关闭了初始的触发作用。目前研究常用的细胞因子包括：提高IL-2、INF-γ、TNF-α等从而提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别作用，增强组织相容性抗原等位基因表达，诱导机体的免疫反应。
4.2 自杀基因治疗。针对肿瘤治疗的自杀基因治疗方法，是通过将表达外源性酶活性的基因导入肿瘤细胞，随后在体内稳定表达的活性酶可以将肿瘤细胞周围的无毒性的药物（称为药物前体）催化成为仅对肿瘤细胞具有细胞毒性的药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。由于在实际应用中，通常采用病毒载体，因此又被称为病毒介导的酶解药物前体疗法（virus directed enzyme prodrug therapy，VDEPT）。自杀基因治疗系统有数十种，其中在癌症研究中运用最多的是胸腺嘧啶激酶基因/丙氧鸟苷系统（TK/GCV）和胞苷脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统（CD/5-FC）。
5 口腔癌基因治疗面临的问题及发展趋势
5.1 多基因异常发生机制和单基因治疗方案的矛盾：口腔癌的发生发展是一个极其复杂的过程，是体内外多因素的多基因异常。而目前肿瘤基因治疗研究中，绝大多数都采用单基因方案，而进入临床试验研究的多基因联合方案还未见报道。因此有必要发展多基因联合方案的研究和应用。
5.2 全身性疾病和局部给药方式的矛盾：如以Ad-p53基因转移治疗口腔癌的方案中，常采用直接将腺病毒注射到肿瘤局部[17]。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。而局部用药只能对局部的病变起作用，药物没有达到的浸润病灶及转移淋巴结无效。因此推荐动脉给药途径，提高基因导入的靶向性和转染效率。
5.3 联合应用：对晚期肿瘤患者，放疗、化疗、热疗以及基因治疗的单一应用其疗效尚不能满足治疗需要，因此推荐对晚期口腔癌患者进行传统疗法与基因治疗的联合应用，从而达到控制肿瘤发展，延长患者带瘤生存时间、提高生存质量的目的。
参考文献
[1] Hyde NC，Prvulovich E，Newman L，el al.A new approach topre-treatnlent assessment of the No neck in oral squamous cell earcinonla：the role of sentinel node biopsy and positron emission tomography，Oral Oncol，2003，39（4）：350—360 [2] Fire A，Xu S，Montgomery MK，et a1.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegan，Nature，1998，391：806-11
[3] Clark J，Ding S.Generation of RNAi libraries for high-throughput Screens，Biomed Biotechnol，2006，4（1）：1-7
[4] Achim A.Gene silencing through RNA interference（RNAi）in vivo：Strategies based on the direct application of siRNAs，Biotechnol，2006，124（1）：12-25
[5] Hannon GJ.RNA interference，Nature，2002，418（6894）：244-51
[6] Xiqiang Liu，Hongzhang Huang，et a1.Dendrimers-delivered short hairpin RNA targeting hTERT inhibits oral cancer cell growth in vitro and in vivo，Biochemical Pharmacology，2011.82，17–23
[7] Kudo Y，Kitajima S，Ogawa I，et a1.Small interfering RNA targeting of S phase kinase—interacting protein 2 inhibits cell growth of oral cancer cells by inhibiting p27 degradation，Mol Cancer Tiler，2005，4（3）：471-6
[8] Kitajima S，Kudo Y，Ogawa I，et a1.Role of Cksl overexpmssion in oral squamous cell carcinomas：cooperation with Skp2 in promoting p27 degradation，Am J Path01，2004，165（6）：2147-55
[9] Xinhua Liang，Xiaoqin Yang，Yaling Tang，et a1.RNAi-mediated downregulation of urokinase plasminogen activator receptor inhibits proliferation，adhesion，migration and invasion in oral cancer cells，Oral Oncology，2008，44 1172-1180
[10] 许建辉，黄洪章，潘朝斌，张彬，王建广，张磊涛，Survivin基因沉默增强人舌鳞癌细胞株Tca8113对顺铂的敏感性，中华口腔医学杂志，2007，42（5）：280.283
[11] Yin ZH，Ren CP，Li F，et a1.Suppression of bcl-2 gene by RNA interference increases chemosensitivity to eisplatin in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE 1，Acta Biochim Biophys Sin，2004，36（11）：749-53
[12] Shen HL，Xu W，Wu ZY，Zhou LL，Qin lU，Tang HR.Vector-based RNAi approach to isoform specific downregulation of vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in human leukemia cells，Leuk Ras，2006，10-9
[13] Nozaki S，Endo Y，Nakahara H，ct a1.Inhibition of invasion and metastasis in oral cancer by targetingn urokinase-type plasminogen activator receptor，Oral Onc01，2005，41（9）：878-83
[14] Zhang Q，Zhang ZF，Rao JY，et a1.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF-lalpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas，Int J Cancer，2004.1l1（6）：849
[15] Doody JF，Wang Y，Patel SN，et a1.Inhibitory activity of cetuximab on epidermal gmwth factor receptor mutations in non small cell lung cancer.Mol Cancer Ther，2007，6（10）：264212651.
[16] Nozaki S，Endo Y，Nakahara H，ct a1.Inhibition of invasion and metastasis in oral cancer by targetingn urokinase-type plasminogen activator receptor，Oral Onc01，2005，41（9）：878-83 [17] Zhang Q，Zhang ZF，Rao JY，et a1.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF-lalpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas，Int J Cancer，2004.1l1（6）：849
[18] Edelstein ML，Abedi MR，Wixon J.Gene therapy clinical trials worldwide to 2007 - an update.J Gene Med，2007，9（10）：833-842.
[19] Doody JF，Wang Y，Patel SN，et a1.Inhibitory activity of cetuximab on epidermal gmwth factor receptor mutations in non small cell lung cancer.Mol Cancer Ther，2007，6（10）：264212651.
[20] Pfister DG，Su YB，Kraus DH，et a1.Concurrent cetuximab，cisplatin，and concomitant boost radiotherapy for locoregionally advanced，squamous cell head and neck cancer：a pilot phaseⅡ study of a new combined-modality paradigm.J Clin 0nc01.2006，24（7）：1072-1078.
[21] Bonner JA，Harari PM，Giralt J，et aL Radiotheralpy plus cenlximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck.N Engl J Med，2006，354（6）：567.578.
[22] Burtness B，Goldwasser MA，Flood W，et a1.PhaseⅢ randomized trial of cisplatin plus placebo compared with cisplatin plus cetuximab in metastatic/recunrrent head and neck cancer：an eastern cooperative oncology group study.J Clin Oncol，2005，23（34）：8646-8654
关键词：RNA干扰 口腔癌 基因治疗
【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）04-0039-02
口腔癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全身恶性肿瘤第六位，局部复发率高，预后较差，超过半数的晚期口腔癌患者生存不足1年[1]。口腔癌发生的根本原因是基因水平的变异。基因治疗（gene therapy）是运用分子生物学的技术，通过基因变换的方法达到治疗人类疾病的目的，包括转染新遗传物质和对现存遗传物质进行加工，从而使疾病在基因水平得以治疗，是一种分子生物学和现代医学相结合的新兴技术。基因治疗的疾病包括心血管疾病、感染性疾病、遗传病、恶性肿瘤。近年来RNAi技术的不断成熟，使其在医学领域迅速发展，尤其在癌症的治疗方面，已经成为基因治疗领域的研究热点，并且部分学者已经取得了重大的突破。因此，基因治疗在口腔癌的治疗和预后判断方面占了非常重要的地位。
RNAi是1998年由Fire[2]等在新杆状线虫中首次发现的一种序列特异性的基因转导后的沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。它通过一段与靶基因序列同源的双链DNA（double stranded DNA，dsDNA）裂解所产生的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）导致同源mRNA降解从而使目的基因失表达。
1 RNAi的调控机制
在不同生物物种中，RNAi作用的机制各不相同，大致可分为大于30nt（核苷酸）的非特异效应长的双链RNA和21～23nt的特异效应的短双链RNA [3，4]。肿瘤基因治疗主要是在转录、转录后、翻译等水平实现RNAi的特异性调控效应。
1.1 转录水平的调控主要通过siRNA与互补DNA直接结合发挥作用，激发同源的DNA甲基化加强，限制目的基因转录，关闭其表达，进而导致基因的沉默。但是甲基化如果出现在启动子区域，转录就不能进行，甲基化出现在编码区，则转录继续进行，但在转录后水平上实现基因沉默。
1.2 转录后水平的调控可分起始阶段和效应阶段[5]。起始阶段主要包括dsRNA的导人和切割。导入包括外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式导入dsRNA；切割则是指dsRNA在细胞内切酶（dicer）的作用下切割成2l～23 nt长度的siRNA[6]。效应阶段是指在siRNA反义链的指导下，双链siRNA与1个RNA酶结合形成沉默复合体（RNA induced si1encing complex，RISC）[7]，然后siRNA双链解螺旋，正义链释放，激活RISC，识别互补的靶mRNA，siRNA的反义链与复合体换位，并在距siRNA 3’末端的12nt处切割目的mRNA，使其丧失转录信息。
1.3 翻译水平上的调控是抑止相应mRNA的翻译，使蛋白质的表达受阻，其中小时序RNA（small temporal RNA，stRNA）起重要作用（长度约70nt的RNA形成的茎环样前体），经dicer酶作用后形成长约2l～23 nt的dsRNA，通过RISC结合在相应mRNA的3’末端非翻译区上，进而阻断mRNA的翻译。
2 RNAi技术在口腔癌中的实验研究
2.1 下调凋亡抑制基因或癌基因的表达。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase protein，hTERT）基因较高的表达于人口腔癌中，其作用机制是：hTERT高表达后合成端粒重复序列，以弥补细胞分裂过程中的端粒短缩，促进癌细胞分化、抑制凋亡发生，最终导致癌细胞永生化。刘希强、黄鸿章[8]等利用RNAi技术，构建了慢病毒重组hTERT质粒载体并导入口腔癌细胞株Tca8113及裸鼠皮下移植瘤内，发现siRNA诱导的RNAi明显抑制hTERT基因的表达，从而抑制了Tca8113细胞的增殖。S期激酶相关蛋白（S-phase kinase associated protein2，Skp2）基因是潜在的原癌基因，其表达产物Skp2蛋白不但是泛素化的必要条件，也参与P27蛋白的降解。在口腔鳞状细胞癌中P27蛋白低表达而Skp2蛋白过度表达。日本学者Kudo Y[9]通过RNAi沉默Skp2基因，发现转染的口腔癌细胞中Skp2蛋白表达减少而P27蛋白表达增加，裸鼠体内同样抑制了肿瘤的增殖，为口腔癌的基因治疗提供了可能的靶基因。
2.2 上调抑癌基因的表达。抑癌基因p27的异常与肿瘤的发生密切相关，在大部分的癌细胞中，都可以检测到p27基因表达下调。角蛋白（Creek Keratin Shampoo，CKs1）的表达与p27的下调呈反相关。Kitajimat[10]等用特异的siRNA对口腔鳞状细胞癌（舌癌和牙龈癌）细胞中的CKsl进行干扰，成功抑制了CKs1基因的表达并诱导了p27在细胞中的积累，从而抑制了口腔鳞状细胞癌细胞的生长。
2.3 抑制与信号转导相关的酶基因的表达。某些癌基因的激活会造成正常信号通路的紊乱，而影响细胞正常的繁殖凋亡，引起肿瘤。siRNA可以高效、特异地封闭这些基因的转录产物受体，却不影响其他基因的表达。梁新华[11]等通过RNAi引起尿激酶纤溶酶原激活物受体的低表达，成功抑制口腔癌细胞的增殖。
2.4 抑制耐药基因的表达。恶性肿瘤化疗失败的主要原因是耐药性，耐药基因的表达很大程度地影响化疗药物的效果。Survivin是一种凋亡抑制基因，特异性地表达于肿瘤细胞，通过抑制终末效应蛋白caspase-3和7发挥其抑制肿瘤细胞凋亡的作用。许建辉、黄洪章[12]等人用特异性siRNA干扰口腔鳞状细胞癌中Survivin的表达，抑制Tca8113细胞增殖和增加caspase-3活性，促进其凋亡，同时也提高了肿瘤细胞对放射线及化疗药物的敏感性。Bcl-2基因是另一种重要的凋亡抑制基因，其编码蛋白Bcl-2在肿瘤细胞中高表达，增强了癌细胞的存活力，拮抗化疗药物诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用，与肿瘤耐药性的形成密切相关。Yin ZH等[13]用靶向BCL-2的shRNA的载体转染鼻咽癌细胞株CNE1，抑制BCL-2蛋白的表达，影响细胞增殖的效果不明显，但癌细胞对顺铂的敏感性增强。此外，Souichi Yanamoto[16]也通过沉默的p53R2基因提高了口腔癌细胞对五氟脲嘧啶的敏感性。 2.5 抗血管生成基因治疗。口腔癌也是血管依赖性的肿瘤，肿瘤新生血管为其生长提供养分的输送及代谢物的输出。但是肿瘤血管通常缺乏平滑肌，基底膜存在不规则的漏洞，为肿瘤的转移提供可能。抗血管生成得基因治疗主要通过抑制肿瘤血管的生成，来抑制肿瘤的生长和转移。目前抗血管生成基因主要包括：针对VEGF及其受体（VEGFR）的基因、血管抑素（vasostatin）基因、内皮抑素（endostatin）基因。其中又以VEGF诱导肿瘤血管生成的作用最强、特异性最高，成为抗血管生成基因治疗的首选[14]。Shen[15]等针对VEGF各亚型的siRNA构建成RNAi表达载体，均可特异性地抑制各亚型VEGF的表达，有效地抑制了肿瘤细胞的生长。u-PAR主要参与细胞分化、血管形成、细胞迁移、细胞外基质降解和组织重建等过程。在高度恶性的口腔癌细胞OSC-19中，u-PAR是其侵袭和转移所必需的。Nozaki[16]应用u-PAR特异的siRNA转染该细胞，沉默u-PAR基因，实现抑制了OSC-19细胞的侵袭和转移。另外，HIF-1a过表达与肿瘤侵袭性的强弱密切相关，Zhang等[17]应用siRNA的方法敲除舌癌细胞株SCC-4和SCC-9的HIF-1a基因，成功抑制了SCC-4和SCC-9的增殖并且诱导了该细胞的凋亡，为用干扰HIF-1a治疗人舌鳞状细胞癌提供了理论及实验依据。
3 RNAi技术在口腔癌中的应用
目前，应用于口腔癌基因治疗的药物只有重组腺病毒介导的p53和西妥昔单抗。美国研究的重组腺病毒p53（Ad-p53）I～Ⅲ期临床试验在多个临床实验中心的近千人中进行，主要通过瘤内多点注射，少量通过静脉给药，并与放化疗联合应用。结果表明：Ad-p53瘤内注射治疗复发性头颈部鳞癌安全、有效，只有发热和注射部位疼痛是最常见的不良反应[18]。同期研究，在手术切除的晚期口腔癌患者术中给予Ad-p53治疗，术后联合放化疗，证实了手术时利用Ad-p53抑制可能残存肿瘤细胞，以及联合放化疗治疗的可行性、安全性和有效性[18]。2003年FDA认定Ad-p53可延长复发性不可手术切除的头颈部鳞状细胞癌患者生存时间，推迟疾病进展时间。
西妥昔单抗作为EGFR的单克隆抗体能够与EGFR的内源性EGF-TGF-Ⅱ竞争性地与EGFR胞外配体区结合，降低EGFR自身磷酸化，阻断下游信号转导通路，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信号的下传，抑制肿瘤细胞增殖[19]。目前，多采用全身给药（静脉滴注）的方法治疗头颈肿瘤患者的西妥昔单抗，且多与放、化疗等常规疗法联合应用。Pfister等[20，21]对20余例临床晚期患者（I和Ⅳ期）随机分为对照组和治疗组，其中对照组采用放疗（1.8Gy/d、共70Gy）和通过静脉给药顺铂（100 mg/m2），而治疗组为放疗（1.8Gy/d、共70Gy）加静脉给药西妥昔单抗（400 mg/m2）进行I期和Ⅱ期临床试验，取得了良好的治疗效果；随后的Ⅲ期试验证实，西妥昔单抗与放疗联合可显著提高患者2到3年的生存率。对于复发或转移且对顺铂类药物产生耐药性的头颈部鳞癌患者，应用西妥昔单抗后，部分患者可恢复或提高对顺铂类药物的敏感性[22]。
4 口腔癌的其他基因治疗方法
4.1 免疫基因治疗。免疫基因治疗是指结合机体自身的免疫机制将特定的外源基因转入肿瘤细胞中，并使其高水平表达相关的细胞因子或MHC抗原，从而激化特异性的抗肿瘤免疫作用。使用遗传工程技术处理肿瘤细胞，使其携带特定细胞因子基因，注射至机体后可以在肿瘤位点持续稳定的表达并释放所携带的细胞因子。注射活的携带特定细胞因子基因的肿瘤细胞，经过增殖会产生更多的抗原，提高细胞因子浓度，进而达到生物学和药理学所需的阈值，引起抗肿瘤的特异性免疫反应。随着免疫反应的进行，肿瘤细胞被杀死，从而关闭了初始的触发作用。目前研究常用的细胞因子包括：提高IL-2、INF-γ、TNF-α等从而提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别作用，增强组织相容性抗原等位基因表达，诱导机体的免疫反应。
4.2 自杀基因治疗。针对肿瘤治疗的自杀基因治疗方法，是通过将表达外源性酶活性的基因导入肿瘤细胞，随后在体内稳定表达的活性酶可以将肿瘤细胞周围的无毒性的药物（称为药物前体）催化成为仅对肿瘤细胞具有细胞毒性的药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。由于在实际应用中，通常采用病毒载体，因此又被称为病毒介导的酶解药物前体疗法（virus directed enzyme prodrug therapy，VDEPT）。自杀基因治疗系统有数十种，其中在癌症研究中运用最多的是胸腺嘧啶激酶基因/丙氧鸟苷系统（TK/GCV）和胞苷脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统（CD/5-FC）。
5 口腔癌基因治疗面临的问题及发展趋势
5.1 多基因异常发生机制和单基因治疗方案的矛盾：口腔癌的发生发展是一个极其复杂的过程，是体内外多因素的多基因异常。而目前肿瘤基因治疗研究中，绝大多数都采用单基因方案，而进入临床试验研究的多基因联合方案还未见报道。因此有必要发展多基因联合方案的研究和应用。
5.2 全身性疾病和局部给药方式的矛盾：如以Ad-p53基因转移治疗口腔癌的方案中，常采用直接将腺病毒注射到肿瘤局部[17]。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。而局部用药只能对局部的病变起作用，药物没有达到的浸润病灶及转移淋巴结无效。因此推荐动脉给药途径，提高基因导入的靶向性和转染效率。
5.3 联合应用：对晚期肿瘤患者，放疗、化疗、热疗以及基因治疗的单一应用其疗效尚不能满足治疗需要，因此推荐对晚期口腔癌患者进行传统疗法与基因治疗的联合应用，从而达到控制肿瘤发展，延长患者带瘤生存时间、提高生存质量的目的。
参考文献
[1] Hyde NC，Prvulovich E，Newman L，el al.A new approach topre-treatnlent assessment of the No neck in oral squamous cell earcinonla：the role of sentinel node biopsy and positron emission tomography，Oral Oncol，2003，39（4）：350—360 [2] Fire A，Xu S，Montgomery MK，et a1.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegan，Nature，1998，391：806-11
[3] Clark J，Ding S.Generation of RNAi libraries for high-throughput Screens，Biomed Biotechnol，2006，4（1）：1-7
[4] Achim A.Gene silencing through RNA interference（RNAi）in vivo：Strategies based on the direct application of siRNAs，Biotechnol，2006，124（1）：12-25
[5] Hannon GJ.RNA interference，Nature，2002，418（6894）：244-51
[6] Xiqiang Liu，Hongzhang Huang，et a1.Dendrimers-delivered short hairpin RNA targeting hTERT inhibits oral cancer cell growth in vitro and in vivo，Biochemical Pharmacology，2011.82，17–23
[7] Kudo Y，Kitajima S，Ogawa I，et a1.Small interfering RNA targeting of S phase kinase—interacting protein 2 inhibits cell growth of oral cancer cells by inhibiting p27 degradation，Mol Cancer Tiler，2005，4（3）：471-6
[8] Kitajima S，Kudo Y，Ogawa I，et a1.Role of Cksl overexpmssion in oral squamous cell carcinomas：cooperation with Skp2 in promoting p27 degradation，Am J Path01，2004，165（6）：2147-55
[9] Xinhua Liang，Xiaoqin Yang，Yaling Tang，et a1.RNAi-mediated downregulation of urokinase plasminogen activator receptor inhibits proliferation，adhesion，migration and invasion in oral cancer cells，Oral Oncology，2008，44 1172-1180
[10] 许建辉，黄洪章，潘朝斌，张彬，王建广，张磊涛，Survivin基因沉默增强人舌鳞癌细胞株Tca8113对顺铂的敏感性，中华口腔医学杂志，2007，42（5）：280.283
[11] Yin ZH，Ren CP，Li F，et a1.Suppression of bcl-2 gene by RNA interference increases chemosensitivity to eisplatin in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE 1，Acta Biochim Biophys Sin，2004，36（11）：749-53
[12] Shen HL，Xu W，Wu ZY，Zhou LL，Qin lU，Tang HR.Vector-based RNAi approach to isoform specific downregulation of vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in human leukemia cells，Leuk Ras，2006，10-9
[13] Nozaki S，Endo Y，Nakahara H，ct a1.Inhibition of invasion and metastasis in oral cancer by targetingn urokinase-type plasminogen activator receptor，Oral Onc01，2005，41（9）：878-83
[14] Zhang Q，Zhang ZF，Rao JY，et a1.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF-lalpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas，Int J Cancer，2004.1l1（6）：849
[15] Doody JF，Wang Y，Patel SN，et a1.Inhibitory activity of cetuximab on epidermal gmwth factor receptor mutations in non small cell lung cancer.Mol Cancer Ther，2007，6（10）：264212651.
[16] Nozaki S，Endo Y，Nakahara H，ct a1.Inhibition of invasion and metastasis in oral cancer by targetingn urokinase-type plasminogen activator receptor，Oral Onc01，2005，41（9）：878-83 [17] Zhang Q，Zhang ZF，Rao JY，et a1.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF-lalpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas，Int J Cancer，2004.1l1（6）：849
[18] Edelstein ML，Abedi MR，Wixon J.Gene therapy clinical trials worldwide to 2007 - an update.J Gene Med，2007，9（10）：833-842.
[19] Doody JF，Wang Y，Patel SN，et a1.Inhibitory activity of cetuximab on epidermal gmwth factor receptor mutations in non small cell lung cancer.Mol Cancer Ther，2007，6（10）：264212651.
[20] Pfister DG，Su YB，Kraus DH，et a1.Concurrent cetuximab，cisplatin，and concomitant boost radiotherapy for locoregionally advanced，squamous cell head and neck cancer：a pilot phaseⅡ study of a new combined-modality paradigm.J Clin 0nc01.2006，24（7）：1072-1078.
[21] Bonner JA，Harari PM，Giralt J，et aL Radiotheralpy plus cenlximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck.N Engl J Med，2006，354（6）：567.578.
[22] Burtness B，Goldwasser MA，Flood W，et a1.PhaseⅢ randomized trial of cisplatin plus placebo compared with cisplatin plus cetuximab in metastatic/recunrrent head and neck cancer：an eastern cooperative oncology group study.J Clin Oncol，2005，23（34）：8646-8654