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目的研究不同强度脉冲电磁场对大鼠颅骨成骨细胞增殖与成熟矿化的影响及其脉冲电磁场的时间效应和信号转导机制研究。方法 1.用自制低频脉冲电磁场细胞处理仪(专利号:ZL 2011 10423102.0)产生的50Hz脉冲电磁场(Pulse electromagnetic fields,PEMFs)每天处理体外培养大鼠颅骨成骨细胞(Rat Skull Osteoblasts,OB),OB随机分为7组,分别为Con(0mT)、0.6 mT、1.2 mT、1.8 mT、2.4 mT、3.0 mT和3.6 mT组,以MTT法检测细胞增殖,以胞内碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、ALP阳性克隆及成骨分化标志性基因的表达量为依据,判定不同强度PEMFs对成骨性分化的影响。2.用最佳强度50Hz 0.6mTPEMFs处理体外培养成骨细胞0、0.5、1.0、1.5、2、3.0、6.0、9.0、12h,以碱性磷酸酶活性,成骨分化标志性基因的表达量,以及蛋白印迹检测成骨分化标志性蛋白的量,来判断脉冲电磁场的短时间效应。3.用免疫荧光染色法观察Smad1/5/8在脉冲电磁场处理中发生核转位的情况,以及用BMP信号通路的抑制剂LDN193189阻断该通路后,观察Smad1/5/8的核转位,碱性磷酸酶活性,ALP阳性克隆,钙盐沉积量,成骨性分化基因表达,成骨性分化蛋白表达的变化。结果 1.0B经每日不同强度的脉冲电磁场处理后,0.6 mT组促细胞增殖作用最强,且该组ALP活性也最高;经磁场处理6、9、12 d后钙盐沉积量逐渐增加,6个PEMFs组的钙盐沉积量均高于对照组,尤以0.6 mT组最高。ALP阳性克隆数、钙化结节数以及Bmp-2和Coll mRNA的表达也是0.6mT组均显著高于对照组。2.50Hz 0.6mTPEMFs在1.5、2、3、12h碱性磷酸酶活性显著高于对照组,而0.5h低于对照组,成骨性分化Runx-2基因在6、9h显著低于对照组,其他组与对照组相差不大,Runx-2的蛋白表达在1、1.5、2、12h显著高于对照组,0.5、6h显著低于对照组。3.50Hz 0.6mT脉冲电磁场处理0B 2h后发生Smads1/5/8的核转位,但6h时核转位消失,加抑制剂LDN193189,再用脉冲电磁场处理成骨细胞时,Smads1/5/8的核转位消失,碱性磷酸酶活性降低,ALP阳性克隆数减少,钙盐沉积量减少,成骨性分化指标Runx-2、Osx、Col1的基因和蛋白表达减少。结论 PEMFs促进骨形成活性具有磁场强度的选择性,0.6mT 50Hz脉冲电磁场最佳促进骨形成,PEMFs促进骨形成活性还具有处理时间的选择性,在短时间效应内,直接作用于成骨性分化蛋白,而不直接作用于成骨性分化的基因,即在短时间内脉冲电磁场可能通过调节蛋白质的变化直接促进成骨性分化。BMP-Smad信号参与了脉冲电磁场促进骨形成过程,脉冲电磁场通过促使Smad 1/5/8的核转位,促使Runx-2和Osx的表达。