论文部分内容阅读
研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）是威胁人类健康的“头号杀手”。急性冠脉综合征（acute coronary syndromes,ACS）是冠心病中最严重的一种类型,包括 ST 段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）和非 ST 段抬高型急型冠脉综合征（Non-ST-segment elevation acute coronary syndrome,NST-ACS）。ACS的主要发病机制是冠状动脉粥样硬化斑块发生破裂或侵蚀,导致心肌组织缺血缺氧。近年来研究表明免疫炎症反应在ACS的发生及损伤修复中发挥重要作用。自然杀伤细胞（natural killer cells,NK细胞）是一种先天性免疫细胞,具有迅速识别和杀死感染或肿瘤细胞的功能。既往研究显示,NK细胞存在于动脉粥样硬化斑块组织中;在慢性炎症刺激下,NK细胞可促进动脉粥样硬化斑块的形成。近年来研究提示ACS患者外周血NK细胞数量增多或减少,NK细胞亚群亦发生显著变化,致NK细胞杀伤功能受损。而NK细胞及其亚群在ACS发生发展中的具体作用及机制不清楚。因此,本研究旨在探索ACS患者外周血中NK细胞及其亚群的变化情况,并揭示NK细胞在ACS发生发展中的作用。研究目的探讨NK细胞及其表面受体在ACS患者外周血中表达的差异及其临床意义。研究方法第一部分1.收集急性心肌梗死患者（AMI组,35例）及对照组（Control组,26例）外周血10ml于EDTA抗凝管中,提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,运用流式细胞术分析研究人群外周血中NK细胞及其亚群的比例。2.收集研究人群年龄、身高、体重、血压、血脂、肌钙蛋白Ⅰ（cardiactroponinⅠ,cTnI）、N末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP）、射血分数（ejection fractions,EF值）、病变血管数目等临床资料,计算冠脉Gensini评分、GRACE评分,分析AMI患者NK细胞及其亚群的比例与这些指标的关系。第二部分1.使用免疫磁珠阴性分选法分选出急性心肌梗死患者（AMI组,52例）、不稳定型心绞痛患者（UA组,35例）及对照组（Control组,30例）外周血NK细胞并提取其总 RNA,运用实时定量 PCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR）方法检测NK细胞表面受体在各组中的表达。2.对AMI患者NK细胞表面受体与cTnⅠ、NT-proBNP、EF值、病变血管数目、冠脉Gensini评分、GRACE评分等指标进行相关性分析。研究结果第一部分1.AMI患者外周血中总NK细胞（即CD3-CD56+NK细胞,18.08±1.79%vs 13.15±1.37%）、CD3-CD56dimNK细胞（17.33±1.58%vs 13.19±1.27%）的比例较对照组均显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.与对照组相比,AMI患者外周血中CD94+NK细胞（55.73±20.87%vs 69.06±19.75%）、KIR2DL5+NK细胞（20.96±19.86%vs 35.25±25.2%）、NKG2A+NK细胞（53.68±14.08%vs 62.62±10.93%）、NKG2C+NK细胞（36.51±19.59%vs 46.86±19.12%）、NKG2D+NK细胞（66.98±15.67%vs 74.61±13.1%）和 NKp46+NK细胞（31.45±3.08%vs 42.34±4.07%）的比例均显著降低（P＜0.05）。而KIR2DL1+、KIR2DL2+、KIR3DL1+、NKp30+、NKp44+、CD57+、CD11a+、DNAM-1+、NTB-A+、2B4+、FasL+、TRAIL+的NK细胞亚群在两组之间的差异无统计学意义。3.在AMI患者冠脉单支病变、双支病变及三支病变中,总NK细胞（27.43±10.21%vs 18.41±7.40%vs 12.71±6.96%）及 NKG2A+NK 细胞（58.55±12.36%vs 56.72±10.37%vs 45.87±12.58%）、NKG2D+NK 细胞（75.58±5.88%vs 73.77±14.271%vs 64.74±13.19%）的比例随着病变累及的数目增多而减少;KIR2DL5+NK细胞随着病变累及的数目增多而增加（8.51%±5.26%vs 16.20%±16.60%27.81%±22.19%）。与三支病变组相比,AMI患者单支病变组中KIR2DL5+NK细胞的比例显著降低（P＜0.05）,NKG2A+NK细胞、NKG2D+NK细胞的比例均显著升高（P＜0.05）;而双支病变组中NKG2A+NK细胞的比例显著升高（P＜0.05）。然而CD94+NK细胞、NKG2C+NK细胞与NKp46+NK细胞的比例在三组间比较差异无统计学意义,两两间比较的差异也无统计学意义。4.在AMI患者中,NK细胞与降钙素原呈正相关（R=0.537,P=0.026）,而与EF值、cTnⅠ、Gensini评分、GRACE评分等无相关性。NKG2C+NK细胞与肌钙蛋白Ⅰ呈正相关（R=0.346,P=0.042）。NKG2D+NK细胞与EF值呈正相关（R=0.434,P=0.009）,与 GRACE评分呈正相关（R=0.382,P=0.024）。第二部分1.与对照组相比,AMI患者外周血中NK细胞抑制性受体NKG2A及活化性受体NKG2C、NKG2D表达均显著降低（P＜0.05）,而AMI组与UA组及UA组与对照组之间比较均无显著差异。此外,AMI患者抑制性受体CD94较UA组与对照组均显著减少（P＜0.05）。然而,AMI患者KIR2DL5、NKp46的表达与不稳定型心绞痛患者及对照组比较结果均无统计学意义。2.AMI患者NKG2A（1.14±0.78vs 0.96±1.16vs 0.20±0.20）、NKG2C（1.09±0.60 vs 0.69±0.47 vs 0.59±0.51）随着病变累及的数目增多而减少。三组间两两比较结果显示,与三支病变相比,NKG2A在单支及双支病变组均显著升高,NKG2D在双支病变组显著升高（P＜0.05）。3.根据相关性分析得出,在AMI患者中,NKG2A与GRACE评分呈正相关（R=0.478,P=0.007）。NKG2C 与降钙素原呈正相关（R=0.428,P=0.042）,NKG2D 与 GRACE 评分呈正相关（R=0.441,P=0.012）。研究结论:1.AMI患者外周血中总NK细胞、CD3-CD56dimNK细胞增加,同时NK细胞表面受体表达失调,提示NK细胞与心肌梗死早期非特异性免疫炎症反应的激活有关。2.AMI患者NK细胞及NK细胞表面受体NKG2A、NKG2D的表达随着病变累及的数目的增多而减少,表明了 NK细胞可能参与了动脉粥样硬化斑块的形成过程。3.AMI患者NKG2A、NKG2D的表达与GRACE评分呈正相关。总之,我们的研究发现NK细胞及其部分表面受体在AMI患者外周血中表达存在显著差异,它们可能参与了 AMI发生发展过程中的免疫炎症反应,有可能作为急性心肌梗死诊断及预后的评价指标。