胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,虽然近年来胃癌的癌症发病率和死亡率呈下降趋势,但是疾病负担仍然较重。探索胃癌的发病机制,寻找有效的胃癌诊断和治疗靶点对改善胃癌患者预后具有重要的意义。Goosecoid（GSC）是胚胎发育过程中参与细胞极化和迁移的同源异型框（Homeobox）转录因子,具有高度稳定性,是良好的候选生物标志物。本研究中,我们通过分析胃癌RNA-Seq数据发现GSC在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,且GSC高表达的胃癌患者预后较差。这些发现提示GSC有可能作为原癌基因促进胃癌的发生和发展,然而目前关于GSC在胃癌发生发展中的分子机制尚不清楚,探讨其具体的作用机制,为胃癌的诊疗提供一定的研究方向。第一部分GSC在胃癌组织中的表达目的:研究GSC在胃癌组织中的表达及其对患者生存的影响。方法:1.通过TNMplot数据库和Ualcan数据库分析胃癌组织中GSC的表达水平。2.通过Ualcan数据库评估胃癌组织中GSC的表达与肿瘤分期的关系。3.通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析胃癌组织中GSC的表达对患者生存的影响。4.收集手术切除的胃癌组织样本,通过免疫组织化学方法检测GSC在胃癌组织中的表达情况。5.通过TIMER数据库评估胃癌组织中GSC表达与免疫细胞浸润的相关性。结果:1.TNMplot数据库和Ualcan数据库的RNA-Seq data分析结果显示,与正常胃黏膜组织样本相比,GSC在胃癌组织中表达升高,结果具有统计学意义（P=6.86e-27,P=2.78e-9）。2.Ualcan数据库分析显示,GSC在进展期胃癌（StageⅡ、StageⅢ）和晚期胃癌（StageⅣ）中的表达显著高于早期胃癌（StageⅠ）,结果具有统计学意义（P＜0.05）。3.Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示胃癌组织中GSC高表达是胃癌患者预后不良的危险因素（HR＞1）,GSC高表达组的胃癌患者总体生存期、无进展生存期及进展后生存期较GSC低表达组的患者明显缩短（P=0.00042,P=0.043,P=2.4e-6）。4.我们收集8例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织,免疫组织化学染色（Immunochemistry,IHC）结果显示GSC在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。5.TIMER数据库分析结果显示胃癌中巨噬细胞的浸润水平与胃癌组织中GSC的表达呈正相关关系（COR=0.209,P=5.03e-5）。进一步分析显示,胃癌组织中肿瘤相关巨噬细胞的特异性标志物CCL2和CD68的表达水平与GSC的表达呈正相关关系（COR=0.153,P=1.79e-3;COR=0.174,P=3.71e-4）;M1型巨噬细胞特异性标志物INOS（NOS2）与GSC的表达呈负相关关系（COR=-0.132,P=7.21e-3）,M2型巨噬细胞特异性标志物,包括CD163、CD206（MRC1）、IL-10、TGF-β的表达与GSC的表达呈显著正相关关系（COR=0.114,P=2e-2;COR=0.113,P=2.11e-2;COR=0.108,P=2.84e-2;COR=0.211,P=1.48e-5）。小结:我们通过TNMplot数据库和Ualcan数据库分析,发现GSC基因在胃癌组织中表达升高。Ualcan数据库分析显示,GSC在中晚期的胃癌组织中高表达。Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示,GSC高表达的胃癌患者总体生存期、无进展生存期及进展后生存期较GSC低表达的患者明显缩短。TIMER数据库分析结果显示,胃癌组织中GSC的表达与具有M2表型的肿瘤相关巨噬细胞浸润呈正相关关系。第二部分GSC对胃癌细胞生物学功能的影响目的:研究GSC基因对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:1.通过Western blot和免疫荧光分析技术,检测GSC在胃癌细胞系的表达和亚细胞定位。2.在人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901和MGC-803中,利用lipo2000转染GSC-si RNA或者GSC质粒构建瞬时敲低或者过表达GSC的胃癌细胞株,Western blot分析GSC的敲低和过表达效率。3.利用MTS实验和平板克隆形成实验检测瞬时敲低GSC对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。4.采用Transwell、划痕愈合实验和Migrate侵袭实验检测瞬时敲低GSC对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。5.应用MTS实验和平板克隆形成实验检测过表达GSC对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。6.采用Transwell、划痕愈合实验和Migrate侵袭实验检测过表达GSC对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7.利用慢病毒侵染和嘌呤霉素筛选的方法,构建稳定低表达GSC的胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901。8.采用Transwell和Migrate侵袭实验检测稳定低表达GSC的胃癌细胞侵袭转移能力的改变。结果:1.Western blot分析结果显示,与永生化正常胃粘膜上皮细胞GSE-1相比,GSC在胃癌细胞BGC-823、SGC-7901和MGC-803中表达有不同程度的升高,结果具有统计学意义（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。激光共聚焦显微镜结果显示GSC主要表达于胃癌细胞的细胞核中。2.Western blot结果显示,与对照组相比,在转染GSC-si RNA和GSC质粒的胃癌细胞BGC-823、SGC-7901和MGC-803中,GSC的表达明显降低或者升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.MTS检测结果显示,敲低GSC对BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的增殖能力无明显改变（P＞0.05）。克隆形成实验结果显示,敲低GSC对BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的克隆形成能力无明显影响（P＞0.05）。4.Transwell和Migrate实验结果表明,敲低GSC表达可抑制BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。划痕愈合实验结果表明,敲低GSC表达可抑制BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的迁移能力（P＜0.05）。5.MTS检测结果显示,过表达GSC对BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的增殖能力无明显改变（P＞0.05）。克隆形成实验结果显示,过表达GSC对BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的克隆形成能力无明显影响（P＞0.05）。6.Transwell和Migrate实验结果表明,过表达GSC可以促进BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。划痕愈合实验结果表明,过表达GSC可促进BGC-823、SGC-7901和MGC-803细胞的迁移能力（P＜0.001）。7.使用荧光显微镜观察胃癌细胞BGC-823和SGC-7901中慢病毒的侵染效率,并用嘌呤霉素筛选稳定低表达GSC的胃癌细胞株。Western blot结果显示,与对照组胃癌细胞相比,感染sh GSC慢病毒的胃癌细胞BGC-823、SGC-7901中GSC的表达明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.0001）。8.Transwell和Migrate实验结果表明,与对照组胃癌细胞相比,稳定低表达GSC组胃癌细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P＜0.05）。小结:本部分研究结果显示,与GES-1细胞相比,GSC蛋白在人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901和MGC-803中表达有不同程度升高,在胃癌细胞中敲低或者过表达GSC,能够抑制或者促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力,但不影响细胞的增殖能力。第三部分GSC促进胃癌细胞侵袭转移机制的初步研究目的:探索GSC促进胃癌细胞侵袭转移功能的具体分子机制。方法:1.在胃癌细胞SGC-7901中瞬时敲低GSC,利用基因测序技术分析差异基因的功能及通路。2.通过TIMER数据库分析GSC与上皮间质转化相关分子,包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin,以及EMT相关调控因子,包括Twist、Slug、Snail等之间的相关性。3.Western blot检测瞬时敲低GSC的胃癌细胞中EMT相关指标的表达改变。4.Western blot检测稳定敲低GSC的胃癌细胞株中EMT相关指标的表达变化。结果:1.基因测序结果显示,与对照组相比,瞬时敲低GSC的SGC-7901细胞中有1006个表达下调的差异基因（P＜0.05,Fold change＞1.5）,对敲低GSC后下调的基因进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）和Gene Ontology（GO）分析,结果提示GSC可能影响细胞运动和粘附功能。2.TIMER数据库分析结果显示胃癌组织中N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist与GSC的表达呈显著正相关关系（COR=0.273,P=1.65e-8;COR=0.257,P=1.15e-7;COR=0.204,P=2.92e-5;COR=0.148,P=2.51e-3;COR=0.247,P=3.39e-7）,但对E-cadherin的表达无相关关系（COR=-0.002,P=9.1e-1）。3.Western blot验证结果显示在胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中瞬时敲低GSC,N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、Smad2蛋白的表达水平明显降低,但对E-cadherin无明显影响。4.Western blot验证结果显示在稳定敲低GSC的胃癌细胞BGC-823中,Vimentin、Twist、Slug、Snail的表达水平明显降低,但对N-cadherinh和E-cadherin无明显影响。在稳定敲低GSC的胃癌细胞SGC-7901中N-cadherinh、Vimentin、Twist、Slug、Snail的表达水平明显降低,但对E-cadherin无明显影响。小结:基因测序结果显示,GSC参与调控细胞粘附功能和细胞运动。并且生物信息学分析结果显示,胃癌细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist与GSC的表达呈显著正相关关系。通过瞬时和稳定敲低胃癌细胞中的GSC,显著影响了N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail的表达水平。以上结果表明,GSC可能通过上皮-间质转化和细胞运动促进胃癌发展。结论:本研究首次发现GSC在胃癌中高表达,并且GSC在进展期胃癌和晚期胃癌中的表达显著高于早期胃癌。高表达GSC的胃癌患者总体生存期、无进展生存期及进展后生存期较GSC低表达的患者明显缩短。基因测序结果显示GSC可能影响细胞运动和粘附功能,生物信息学分析显示胃癌中GSC与EMT指标的表达相关,在胃癌细胞中瞬时和稳定敲低GSC蛋白的表达验证了这一结果。因此,在胃癌细胞中GSC可能通过增加促进EMT和细胞运动,影响胃癌细胞的侵袭和迁移能力。