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目的肾结石作为泌尿系常见的疾病之一,目前对于其发病机制并无准确的说法,而大多数认为肾结石的形成是晶体在近端小管与髓袢（Henle环）交界处或肾乳头成核、生长、饱和或滞留。随着生活质量的改变全球尿路结石的发病率也不断升高,而10年复发率更是高达50%左右。而目前肾结石的保守治疗大多数是增加液体摄入量和改善饮食结构或口服柠檬酸钾和噻嗪类药物,但长期服用药物具有明显的不良副作用。氧化应激损伤肾脏组织,在肾结石形成的过程中发挥重要的作用,而当STRT3去乙酰化FOXO3a时具有抗氧化的作用。石淋清颗粒作为经验方在前期研究中发现具有减少尿路结石的作用。因此基于SIRT3/FOXO3a信号通路观察石淋清颗粒在预防大鼠草酸钙肾结石氧化应激损伤,以及对大鼠肾脏细胞超微结构的影响,探讨石淋清颗粒预防肾结石形成的作用机制,以便为石淋清颗粒临床应用提供实验依据。方法1实验动物分组、造模与取材1.1分组与造模14-16周180～200g雄性SPF级SD大鼠60只,随机分别为:空白组（A组）、模型组（B组）、低剂量石淋清颗粒组（C组）、中剂量石淋清颗粒组（D组）、高剂量石淋清颗粒组（E组）,抑制剂组:高剂量+3-TYP组（F组）,每组10只。造模方法:除空白组外,其余组均采用1%乙二醇自由饮水,2%氯化铵溶液灌胃每日1次,每次2ml,连续造模4周（28d）。造模的同时空白组和模型组给予等体积生理盐水进行灌胃,低、中、高剂量石淋清颗粒组分别给予0.65g/ml、1.3 g/ml、2.6 g/ml的悬浮液灌胃,每日1次,剂量1ml/100g;抑制剂组为高剂量+25mg/kg腹腔注射SIRT3抑制剂（3-TYP）,两天1次,连续灌胃4周（28d）。1.2取材实验结束前3d将SD大鼠转移至代谢收集笼适应饲养2d后,在实验结束前1d,禁食不禁水,收集每只大鼠24h尿液。用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉,腹主动脉取血并置入4℃冰箱静置,后经离心取淡黄色上清液,分装保存在负80℃冰箱中备用。仔细分离大鼠肾脏组织,左侧标记后置入4%多聚甲醛组织固定液中,并24h后更换一次新组织固定液;右侧取出后冠状面切开后选取任一半取约1mm~3大小肾皮质,并迅速放置2.5%戊二醛电镜固定液中,4h后更换一次新电镜固定液;其余标记后置入冻存管中移入负80℃冰箱中保存备用。2样本检测2.1各组大鼠血、尿生化检测将收集保存备用的血清和尿液分别进行血Cr、血BUN、血Ca2+和血Mg2+检测、尿草酸、尿Ca2+含量。以便了解石淋清颗粒对大鼠草酸钙肾结石形成理化指标和肾功能的影响。2.2各组大鼠肾脏病理切片将固定好的各组大鼠左肾制作成石蜡切片,进行切片染色观察肾脏病理学（HE染色）和肾脏结晶的变化（Von Kossa染色）。2.3透射电镜观察各组大鼠肾脏超微结构将电镜液固定好的右肾组织,通过清洗、脱水、浸透、包埋、修快、半薄切片、制刀并载网和支持膜,制作超薄切片、染色等步骤后在透射电子显微镜（JEM-1400）观察各组大鼠肾小球足突、基膜、线粒体以及肾小管上皮细胞线粒体的超微结构。2.4各组大鼠肾脏组织氧化应激指标检测负80℃冰箱中保存备用的右肾组织研磨成匀浆,离心提取上清液,利用试剂盒检测各组大鼠ROS相对水平,MDA、SOD和OPN含量。2.5免疫组化检测各组大鼠SIRT3、FOXO3a、SOD2的蛋白表达。2.6使用Q-PCR检测各组大鼠SIRT3、FOXO3a、SOD2m RNA表达情况。2.7使用Western Blot检测各组大鼠SIRT3、FOXO3a、SOD2的蛋白表达。结果1石淋清颗粒对各组大鼠一般情况、体重、血清、尿液生化的影响1.1各组大鼠一般情况与A组相比,B组大鼠食欲减退,精神萎靡,毛发枯黄无光泽,并且饮水量减少。与B组相比C组、D组、E组大鼠的饮食状况良好,精神状态较好,毛发光泽,饮水量增加,其中D组较C组和E组较好,而F组与B组无差别。1.2大鼠体重变化实验前各组大鼠体重无明显差异（P＞0.05）。实验结束后,与A组比较B组体重无统计学意义（P＞0.05）,与B组相比,C组、D组、E组体重较高,具有统计学差异（P＜0.05）,F组与B组相比无差异（P＞0.05）。1.3尿液、血清生化情况与A组相比,B组24h尿量、尿p H降低,而24h尿Ox、尿Ca2+升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,与B组相比,C组、D组、E组24h尿量、尿p H值升高,24h尿Ox、尿Ca2+降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;而F组的以上指标没有显著差别（P＞0.05）。与A组相比,B组的血Cr、血BUN、血Ca2+和血Mg2+显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与B组相比,C组、D组、E组的血Cr、血BUN血Ca2+和血Mg2+含量明显降低。而F组各项血清指标与B组相比没有统计学意义（P＞0.05）。2石淋清颗粒对各组大鼠肾脏病理以及肾脏钙结晶的影响2.1各组大鼠肾脏病理（HE染色）变化与A组相比,B组大鼠肾脏结构破坏严重,肾小管和肾小球排列紊乱。与B组相比,C组、D组、E组肾脏结构明显好转;而F组肾脏结构和B组并无明显差别。2.2肾脏钙结晶变化情况与A组相比,B组和F组大鼠肾脏内可见弥漫分布的黑色结晶。而C组、D组、E组黑色结晶明显减少。肾脏结晶评分显示,与A组相比其余各组评分均显著升高。与B组相比C组、D组、E组评分较低,而F组评分较高。3石淋清颗粒对各组大鼠ROS相对水平、MDA、SOD和OPN含量的影响与A组相比,B组ROS相对水平、MDA和OPN含量升高,SOD含量降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,与B组相比,C组、D组、E组ROS相对水平、MDA和OPN含量降低,SOD含量升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,而D组要比C组和E组效果要好;而F组的以上指标没有显著差别（P＞0.05）。4石淋清颗粒对各组大鼠肾脏超微结构变化的影响与A组相比,B组大鼠肾脏基膜增厚,足突融合明显,肾小球线粒体水肿、破裂、线粒体嵴消失明显,肾小管上皮细胞线粒体水肿、破裂、双膜结构破坏,线粒体嵴消失明显,排列紊乱。与B组相比,C组、D组、E组肾小球基膜,足突,足突细胞线粒体损伤得到缓解,肾小管上皮细胞线粒体损伤减轻,并且发现E组可以促进肾小管上细胞线粒体代偿性增生,数目增加;而F组肾脏超微结构损伤没有改善。5石淋清颗粒对各组大鼠SIRT3/FOXO3a通路的影响与A组相比,B组大鼠肾脏内SIRT3、FOXO3a、SOD2表达减少（P＜0.05）,而与B组相比,C组、D组、E组肾脏内SIRT3、FOXO3a、SOD2表达增加（P＜0.05）,F组表达量减少（P＞0.05）。结论石淋清颗粒能够预防大鼠草酸钙肾结石在肾脏的形成,减少氧化应激损伤、改善肾脏超微结构的破坏,保护大鼠肾脏功能,这可能与激活SIRT3/FOXO3a信号通路有关。