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研究背景:宫腔粘连（intrauterine adhesions,IUA）是一种因子宫内膜基底层受损导致的宫腔前后壁部分或全部粘连的妇科疾病。子宫内膜过度纤维化是IUA的主要病理特征。子宫内膜基底层被破坏后,促进内膜基质细胞大量增殖并转分化为肌成纤维细胞,导致细胞外基质大量分泌、沉积。研究表明,纤维化是由多种刺激因素诱导的慢性炎症反应的最终阶段。S100A8/A9属于S100钙结合蛋白家族成员,由S100A8和S100A9两个单体形成异源二聚体蛋白复合物,主要在中性粒细胞等髓系细胞中表达。在炎症过程中,S100A8/A9被主动释放,刺激白细胞募集和诱导细胞因子分泌。S100A8/A9能够促进成纤维细胞的增殖并且向肌成纤维细胞分化,加速细胞外基质分泌、沉积。然而,S100A8/A9在IUA中的作用尚未见报道。当机体发生应激损伤时,S100A8/A9可通过与晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）结合诱导炎症介质表达,参与炎症级联反应。RAGE是一种多配体受体,与配体结合激活JAK/STATs,参与促炎因子诱导的炎症反应。基于临床样本转录组测序结果提示IUA患者子宫内膜S100A8/A9的显著上调,我们推测S100A8/A9通过与RAGE受体结合激活JAK2/STAT3信号通路释放促炎因子和细胞因子,促进基质细胞增殖活化,增加细胞外基质表达,参与IUA子宫内膜纤维化。目前临床治疗IUA的主要方法是宫腔镜下粘连分离术,尽管可以提供解剖结构的修复但是缺乏功能的恢复,术后粘连复发率高。因此寻找更加安全有效的替代疗法成为研究热点。经血来源间充质干细胞（menstrual blood derived stromal cells,Men SCs）是一种来源于女性经血的具有间充质干细胞表型和多向分化潜能的子宫内膜再生细胞。课题组前期研究已经证实Men SCs能通过促进子宫内膜再生治疗IUA。巴马香猪与人的亲缘关系相近,基因组具有明显的同源性,复杂度和结构相似,器官大小和质量接近,有利于深入的机制探索。因此,本研究选用巴马香猪构建IUA动物模型,验证S100A8/A9在Men SCs治疗IUA中的关键作用。综上,本课题首先观察S100A8/A9在IUA患者子宫内膜组织中的表达水平;其次,探究S100A8/A9是否通过调节RAGR/JAK2/STAT3信号通路介导子宫内膜纤维化形成;最后,构建IUA巴马香猪动物模型,探究Men SCs治疗IUA的潜在机制是否与对S100A8/A9表达调控相关。研究方法:1、纳入因IUA于我院行手术治疗的患者,选取粘连部位的子宫内膜及内膜下方瘢痕组织作为IUA组标本,另选取行宫腔镜内膜活检术且术后病理未见异常的子宫内膜作为正常对照组。RT-PCR检测组织标本S100A8、S100A9、COLI、α-SMA基因表达;免疫组化检测S100A8/A9、COLI在子宫内膜组织中的表达;免疫荧光染色检测S100A8/A9与粒细胞共表达情况。2、原代培养子宫内膜基质细胞,选取不同浓度S100A8/A9刺激细胞,CCK8检测细胞增殖,RT-PCR检测炎症相关因子（IL-1、IL-6、TNF）表达。RT-PCR、Western blot、IF检测COLI及α-SMA的表达情况。WB检测RAGE、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3。RAGE阻断剂（FPS-ZM1）或JAK2/STAT3通路抑制剂（AG490）预处理后,再次用S100A8/A9刺激细胞,观察上述指标变化。免疫荧光检测STAT3核转位。3、采用电灼伤法构建猪IUA动物模型,宫腔镜检查评估宫腔粘连程度,采用HE染色、Masson染色、免疫组化,测定子宫内膜厚度、子宫内膜胶原容积分数、计数内膜腺体和微血管数量,测定羟脯氨酸含量。Men SCs子宫内膜局部多点注射后,观察上述指标及S100A8/A9表达变化。结果:1、与对照组相比,IUA患者子宫内膜组织S100A8、S100A9、COLI、α-SMA的基因表达显著增加。免疫组化结果显示IUA患者子宫内膜组织内S100A8/A9、COLI表达量增加,Masson染色胶原含量增加。免疫荧光结果显示S100A8/A9阳性细胞与粒细胞标记物CD15阳性细胞高度重合,提示S100A8/A9可能主要由粒细胞分泌。2、原代培养子宫内膜基质细胞,100ng/ml S100A8/A9可显著促进子宫内膜基质细胞增殖,促进炎症因子IL-1、IL-6表达,促进纤维化相关蛋白COLI、α-SMA表达。S100A8/A9可促进子宫内膜基质细胞RAGE受体蛋白表达,并激活下游JAK2/STAT3信号通路,促进STAT3核转位。FPS-ZM1可抑制S100A8/A9对子宫内膜基质细胞增殖的促进作用,抑制S100A8/A9对子宫内膜基质细胞表达COLI、α-SMA的促进作用,抑制S100A8/A9对JAK2/STAT3信号通路的激活作用,抑制STAT3核转位。AG490可阻断S100A8/A9对子宫内膜基质细胞表达COLI、α-SMA的促进作用。3、电灼子宫内膜后,短期内子宫内膜组织出血、水肿甚至碳化,术后35天子宫内膜厚度变薄、胶原容积分数增加,子宫内膜腺体数量及微血管数量减少,宫腔镜下见宫腔粘连狭小,宫腔内出现大量瘢痕组织及纤维粘连条带,并且电灼对子宫内膜的损伤呈强度依懒性,当电灼强度达到70W时可稳定建立猪IUA模型;电灼子宫内膜后,S100A8/A9及COLI的表达较对照组显著增加;Men SCs治疗可减少猪IUA模型子宫内膜组织中S100A8/A9及COLI的表达,增加子宫内膜厚度,减少胶原容积分数,提升腺体及微血管数量,促进受损子宫内膜修复。结论:1、通过分析转录组测序结果,发现与正常子宫内膜相比炎症相关信号通路在IUA子宫内膜中富集,S100A9是差异性最为显著的炎症因子。IUA患者子宫内膜组织纤维化程度显著提高,S100A8、S100A9的基因相对表达量显著增加,并且S100A8/A9主要来源于粒细胞。2、S100A8/A9可通过上调子宫内膜基质细胞RAGE受体表达并活化下游JAK2/STAT3信号通路显著促进基质细胞增殖、增强炎症因子IL-1和IL-6的表达,提高COLI及α-SMA蛋白表达,促使基质细胞向肌成纤维细胞分化。S100A8/A9对子宫内膜基质细胞具有促炎、促纤维化特性。3、电灼伤法可有效建立稳定的巴马香猪IUA模型,同时电灼伤子宫内膜显著增加S100A8/A9的表达。Men SCs可能通过降低损伤部位S100A8/A9浓度,恢复子宫内膜厚度、腺体及微血管数量,减轻子宫内膜纤维化,起到治疗IUA的作用。