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研究目的:支气管哮喘（简称哮喘）是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病。全球有超过3亿人遭受着哮喘的折磨,它已经成为一个全球性的健康问题。吸入性皮质类固醇（inhaled corticosteroids,ICS）和长效β激动剂（long actingβ-agonists,LABA）的联合应用可以缓解哮喘症状,减少喘息发作的频率。但对于那些未能通过ICS和LABA获得控制的哮喘患者来说,治疗选择有限。ICS剂量的增加通常不会带来额外的收益,副作用的发生风险却会增加。因此,需要寻求新的药物进行治疗干预,以攻克这一疾病。木香内酯（micheliolide,MCL）是一种从小白菊内酯（parthenolide,PTL）半合成获得的愈创木倍半萜内酯类化合物。近年来国内外多项研究显示,MCL具有潜在的抗炎生物活性。在类风湿性关节炎及炎症性肠病等多种疾病模型中,MCL可发挥抑制炎症因子分泌,调节Th1/Th2失衡及抑制炎性小体活化的作用。此外,MCL还在乳腺癌和结肠癌等癌症治疗方面表现出了良好的抗氧化及免疫调节功能。然而,MCL对哮喘模型炎症及氧化应激的干预研究目前尚无报道。因此本课题通过建立MCL干预的哮喘动物及气道上皮细胞模型,试图明确MCL是否能够改善哮喘的炎症及氧化应激。并进一步探索MCL在哮喘中发挥保护作用的机制研究,以期对哮喘今后的药物治疗提供实验性参考。研究方法:一、MCL对哮喘小鼠Th1/Th2失衡、氧化应激及炎性小体活化影响的研究1、哮喘小鼠模型制备与分组。把30只BALB/C小鼠分成5组,每组6只。分别为:正常对照组（简称Control组,此组小鼠应用生理盐水致敏,腹腔注射50μL DMSO）,哮喘组（简称OVA组,此组小鼠用OVA致敏,腹腔注射50μL DMSO）,哮喘+MCL12.5mg/kg组（简称OVA+MCL12.5组,此组小鼠用OVA致敏小鼠,腹腔注射溶于50μL DMSO的MCL,MCL每只鼠用量为12.5mg/kg）,哮喘+MCL25 mg/kg组（简称OVA+MCL25组,此组小鼠用OVA致敏小鼠,腹腔注射溶于50μL DMSO的MCL,MCL每只鼠用量为25mg/kg）,哮喘+MCL50mg/kg组（简称OVA+MCL50组,此组小鼠用OVA致敏小鼠,腹腔注射溶于50μL DMSO的MCL,MCL每只鼠用量为50 mg/kg）。2、MCL对哮喘小鼠气道高反应的影响。在最后一次OVA或者生理盐水激发的24h后,使用无创单室全身体积描记系统间接评估各组小鼠的气道高反应性情况。3、MCL对哮喘小鼠气道炎症的影响。应用瑞氏吉姆萨染色的方法各组小鼠的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中的炎症细胞进行分类计数并计算嗜酸性粒细胞占总炎症细胞总数的百分比;用ELISA的方法检测了各组小鼠血清OVA-s Ig E及细胞因子IL-4,IL-5,IL-13及IFN-γ的水平;各组小鼠肺组织切片进行HE及PAS染色观察气道病理改变;采用q RT-PCR的方法检测了各组小鼠肺组织中细胞因子IL-4,IL-5,IL-13,IFN-γ和趋化因子CCL11,CCL24的m RNA水平;流式细胞术检测各组小鼠脾脏中T淋巴细胞比例。4、MCL对哮喘小鼠气道氧化应激的影响。本实验采用试剂盒检测MCL对哮喘小鼠肺组织氧化应激指标MDA,GSH含量和SOD活性的影响。5、MCL对哮喘小鼠肺组织NLRP3炎性小体活化的影响。采用ELISA的方法检测了小鼠IL-1β和IL-18的水平变化并采用Western Blot方法检测小鼠肺组织NLRP3炎性小体活化相关蛋白的表达。二、MCL对人支气管上皮Beas-2B细胞中炎症、氧化应激及NLRP3炎性小体活化调节作用的研究。1、MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞内的炎症的影响。首先采用CCK8试剂盒对不同浓度MCL作用的Beas-2B细胞的活力水平进行检测。再用ELISA法检测MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞细胞因子IL-6、IL-8及趋化因子CCL11、CCL24水平。2、MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞氧化应激的影响。本实验采用DCFH-DA探针检测MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞内ROS的影响;采用试剂盒检测各组Beas-2B细胞氧化应激指标MDA,GSH含量及SOD活性。3、MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞NLRP3炎性小体活化的影响。采用ELISA法检测MCL对IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞上清液中IL-1β和IL-18的水平影响。并采用Western Blot方法检测IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞NLRP3炎性小体活化相关蛋白ASC,caspase-1,cleaved-caspase-1,IL-1β和NLRP3的表达。三、MCL对哮喘气道NLRP3炎性小体活化及氧化应激保护作用的机制研究。1、采用生信数据分析的方法筛选和MCL在哮喘中发挥作用关系密切的基因。2、采用Western Blot方法检测各组小鼠肺组织中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-P38,P38,p-IκBα,IκBα,p-P65和P65的表达水平。3、采用Western Blot方法检测IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-P38,P38,p-IκBα,IκBα,p-P65和P65的表达水平。4、向应用MCL预处理的IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞中加用NF-κB激活剂白桦脂酸（BA）。用DCFH-DA探针检测各组细胞中ROS水平变化。并应用Western Blot方法检测Beas-2B细胞NLRP3炎性小体活化相关蛋白ASC,caspase-1,cleaved-caspase-1,IL-1β和NLRP3的表达情况。研究结果:一、MCL可以对OVA诱导的哮喘模型中的气道高反应、炎症、氧化应激及NLRP3活化相关的指标发挥调节作用。1、无创单室全身体积描记系统检测各组小鼠的气道高反应性结果显示,给予MCL后的哮喘小鼠Penh值较OVA组小鼠显著降低。2、瑞士吉姆萨染色结果显示给予MCL后的哮喘小鼠BALF中白细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量及嗜酸性粒细胞占总炎症细胞总数的百分比均较OVA组显著降低;HE及PAS染色结果显示应用MCL后哮喘小鼠肺组织气道旁炎症细胞浸润及气道粘液分泌均较切片进行OVA组显著减少;q RT-PCR检测了结果显示应用MCL后哮喘小鼠肺组织中细胞因子IL-4,IL-5,IL-13和趋化因子CCL11,CCL24的m RNA水平较OVA组显著降低,IFN-γ的m RNA水平较OVA组显著升高;ELISA检测结果显示应用MCL后哮喘小鼠血清OVA-s Ig E的水平及BALF中细胞因子IL-4,IL-5及IL-13的水平较OVA组显著降低,IFN-γ的水平较OVA组显著升高;流式细胞仪检测结果显示MCL处理后哮喘小鼠脾脏中CD4+IL-4+Th2细胞比例较OVA组显著降低,CD4+IFN-γ+Th1细胞较OVA组显著升高。3、试剂盒检测结果显示给予MCL后哮喘小鼠肺组织氧化应激指标MDA水平较OVA组显著减少;SOD的活性和GSH水平较OVA组显著增加。4、ELISA检测结果显示给予MCL后哮喘小鼠血清中的IL-1β和IL-18水平较OVA组显著减低;Western Blot检测结果显示给予MCL后哮喘小鼠肺组织中NLRP3炎性小体活化相关蛋白ASC,caspase-1,cleaved-caspase-1,IL-1β和NLRP3的蛋白表达较OVA组显著下降。二、MCL可以对体外哮喘模型IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞中的炎症、氧化应激及NLRP3炎性小体活化相关指标发挥调节作用。1、ELISA检测结果显示当MCL作用于IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞后,其细胞上清液中的细胞因子IL-6、IL-8及趋化因子CCL11、CCL24水平较未经MCL处理组显著减少。2、DCFH-DA探针检测结果显示应用MCL后IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞内ROS较未经MCL处理组显著减少;试剂盒检测显示应用MCL后IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞中氧化应激指标MDA水平较未经MCL处理组显著减少;SOD活性和GSH水平较未经MCL处理组显著增加。3、ELISA法检测给予MCL处理后IL-4+TNF-α共同诱导的Beas-2B细胞上清液中IL-1β和IL-18水平较未处理组显著下降;Western Blot检测结果显示给予MCL处理后IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞NLRP3炎性小体信号活化相关蛋白ASC,caspase-1,cleaved-caspase-1,IL-1β和NLRP3的蛋白表达较未处理组显著下降。三、MCL可以对体内外哮喘模型中的MAPK/NF-κB信号相关蛋白发挥调节作用。1、Western Blot检测结果显示应用MCL后哮喘小鼠肺组织中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-ERK,p-JNK,p-P38,p-IκBα和p-P65的蛋白表达水平较OVA组显著降低;IκBα的蛋白表达较哮喘组显著增高。2、Western Blot检测结果显示应用MCL后IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-ERK,p-JNK,p-P38,p-IκBα和p-P65的蛋白表达水平较未经MCL处理组显著降低;IκBα的蛋白表达较未经MCL处理组显著增高。3、DCFH-DA探针检测结果显示,加用NF-κB激动剂白桦脂酸的MCL10μM+BA组细胞的ROS水平较MCL10μM组明显增高;且Western blot检测显示加用NF-κB激动剂白桦脂酸的MCL10μM+BA组的ASC,caspase-1,cleaved-caspase-1,IL-1β和NLRP3蛋白表达较MCL10μM组显著增高。研究结论:1、MCL可在OVA诱导的哮喘小鼠模型中发挥降低气道高反应,调节Th1/Th2失衡,改善氧化应激及抑制NLRP3炎性小体活化的作用。2、MCL可在体外IL-4+TNF-α共同诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞中发挥抑制炎症、氧化应激及NLRP3炎性小体活化的作用。3、MCL对哮喘气道的保护作用是通过抑制MAPK/NF-κB信号通路实现的。