目的:本研究旨在应用网络药理学方法探讨降脂颗粒组分山奈酚治疗非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的作用机制并通过体内外实验进一步验证,明确肝X受体α（Liver X receptor alpha,LXRα）-血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3）-内质网应激信号通路在非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis,NASH）中的关键作用以及山奈酚的调控作用。方法:1.采用网络药理学方法降脂颗粒治疗NAFLD的潜在作用机制进行分析。具体步骤如下:首先,在人类孟德尔遗传数据库（Online mendelian inheritance in man,OMIM）、治疗靶标数据库（Therapeutic target database,TTD）、疾病关联数据库（Disease connect,DC）和人类基因数据库（Genecards）中检索与NAFLD相关的基因。在中草药有效成分蛋白靶点数据库（Herbal ingredients’targets database,HIT）、中药综合数据库（Traditional Chinese medicine integrative database,TCMID）、化学关联网络数据库（Chemical association networks,STITCH）和中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）数据库中检索降脂颗粒各组分中药含有的化学成分及其作用靶点。然后,将NAFLD和降脂颗粒相关基因上传至京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）,得到NAFLD相关基因和降脂颗粒靶点构成的信号通路,经比较分析得到NAFLD相关基因和降脂颗粒靶点共同调控的基因靶点以及这些靶点所参与的信号通路,再对结果进行进一步分析。2.在网络药理学分析结果的基础上,设计动物实验探讨山奈酚对细胞凋亡通路相关因子的调节作用,具体步骤如下:选用高脂饮食（High fat diet,HFD）诱导的C57BL/6小鼠NASH模型,设正常对照组（C,n=7）、模型组（M,n=8）、山奈酚组（K,n=8）。C组以正常饲料喂养,M、K组以HFD喂养24周。从第21周开始,K组以20mg/kg/day灌胃给药4周,以0.5ml/100g小鼠体质量剂量灌胃给药,C组、M组以等体积的生理盐水灌胃。观察小鼠的一般情况,每日称重。检测小鼠血清肝功能丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein LDL）、甘油三酯（Triglyceride total cholesterol,TG）和总胆固醇（Total Cholesterol,TC）水平以及肝组织中TG和TC水平等生化指标。采用苏木精和伊红（Hematoxylin and eosin stain,HE）染色法、油红O染色法对肝组织进行病理组织学染色并观察。同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测肝组织LXRα-LPCAT3-内质网应激信号通路中关键分子的m RNA及蛋白表达情况。3.从体外细胞学实验角度进一步验证山奈酚对LXRα-LPCAT3-内质网应激信号通路的调节作用。具体步骤如下:设正常对照组（C）、模型组（M）、山奈酚给药组（K）。山奈酚给药组设置20μM、40μM和60μM 3个浓度。收集生长状态良好的Hep G2和AML12细胞,计数,将细胞悬液的浓度调整至5×10~5个/ml,按每孔2ml的量将细胞悬液均匀的铺于6孔板中,培养24h后更换培养基。C组加入2ml新鲜的含1%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）的培养基,和M组加入2ml含1%BSA的培养基含0.375+0.75 m M的棕榈酸油酸混合液（Palmitic acid and oleic acid,PAOA）,山奈酚给药组分别加入2ml含1%BSA的培养基含0.375+0.75 m M的PAOA并有20μM、40μM和60μM山奈酚。24h后收集各组细胞,油红O染色法观察细胞脂滴的变化情况,TG试剂盒检测TG含量的变化。同时采用RT-q PCR和Western Blot检测细胞中LXRα-LPCAT3-内质网应激信号通路中关键分子的m RNA及蛋白表达情况。结果:1.网络药理学分析结果:去除共有成分,共得到NAFLD相关的基因136个,降脂颗粒的化学成分102个（茵陈23个、丹参40个、荷叶25个、虎杖21个、绞股蓝16个）,降脂颗粒的靶点338个（茵陈192个、丹参314个、荷叶253个、虎杖255个、绞股蓝324个）。KEGG分析得到NAFLD相关基因参与调控45条信号通路,降脂颗粒的调控靶点共参与104条信号通路,其中降脂颗粒靶点和NAFLD相关基因共同参与的信号通路共有15条。这些共同参与的信号通路分别为:（1）内分泌抗性（Endocrine resistance）;（2）低氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）信号通路;（3）肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）信号通路;（4）细胞凋亡（Apoptosis）;（5）白介素17（Interleukin 17,IL-17）信号通路;（6）表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制剂;（7）铂类药物抗性（Platinum drug resistance）;（8）叉形头转录因子O亚型（Forkhead box O,Fox O）信号通路;（9）脂肪细胞因子（Adipocytokine）信号通路;（10）长寿调节（Longevity regulating）通路;（11）腺苷单磷酸激活蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）信号通路;（12）缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解;（13）自然杀伤细胞介导的细胞毒性;（14）胰岛素信号通路;（15）脂肪酸降解。我们重点关注在细胞凋亡,该信号通路与内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）有关。2.动物实验结果:HE和油红O染色结果显示山奈酚能有效缓解HFD诱导的NASH模型小鼠脂肪变性的严重程度;肝功能生化检测结果表明山奈酚能降低NASH模型小鼠血清中ALT、AST、HDL、LDL、TG、TC水平（P＜0.05或P＜0.01）;RT-q PCR结果显示山奈酚能降低NASH模型小鼠肝组织中LXRα、LPCAT3以及ERS相关因子PERK、ATF4、ATF6、IRE1α和GRP78的m RNA水平（P＜0.05或P＜0.01）;Western blot结果表明山奈酚能减少NASH模型小鼠肝脏中LPCAT3的表达（P＜0.05）以及PERK、e IF2α和IRE1α的磷酸化水平（P＜0.05或P＜0.01）。3.细胞实验结果:TG检测和油红O染色结果显示与正常对照组相比,模型组用PAOA诱导Hep G2和AML12细胞24h后,细胞中TG的含量和油红脂滴显著升高（P＜0.05）,与模型组相比,山奈酚高浓度组细胞的TG的含量和油红脂滴均明显降低（P＜0.05）。RT-q PCR结果显示与正常对照组相比,两种模型细胞中LXRα、LPCAT3以及ERS相关因子PERK、e IF2α、ATF4、CHOP、IRE1α和GRP78的m RNA水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,与模型组相比,高浓度的山奈酚干预能明显降低它们的表达（P＜0.05或P＜0.01）。Western Blot结果显示与正常对照组相比,两种模型细胞中ERS相关因子e IF2α、ATF4、XBP1、IRE1α和GRP78的蛋白水平均显著升高（P＜0.05）,与模型组相比,高浓度的山奈酚干预能明显降低e IF2α、ATF4、XBP1和GRP78的蛋白水平（P＜0.05或P＜0.01）。结论:1.采用网络药理学方法发现NAFLD相关靶点和降脂颗粒的主要活性成分,及其共同调控的主要作用靶点和通路,聚焦主要活性成分山奈酚对NAFLD的LXRα-LPCAT3-内质网应激相关通路的影响。2.通过动物实验证实了山奈酚可以改善高脂饮食诱导的NASH小鼠的肝损伤。3.通过细胞实验证实了山奈酚可以缓解PAOA诱导的脂肪变性细胞的脂滴浸润。4.通过动物实验和细胞实验初步探讨了山奈酚对LXRα-LPCAT3-内质网应激相关通路的调节作用,实验表明山奈酚可能通过下调该通路中LXRα和LPCAT3的表达水平,从而改善内质网应激,减轻肝脏的脂肪变性和炎症,进而改善NASH的肝脏损伤,达到保护肝脏的作用。