G-四链体用于血管紧张素原的检测及抑制血管生成的研究

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随着分子生物学的快速进展,特别是人类基因组规划的进行,核酸的相关研究越来越成熟。核酸不但起着遗传信息的贮存与输送功能,还能够利用他们的化学结构的变化与其它物质作用,可以作为疾病潜在的诊断和治疗的工具。G-四链体是一种具有多种优良性能的核酸,可通过对目标物的特异性识别能力实现超灵敏检测。血管生成的机制涉及多种病理状态,血管紧张素原(AGT)参与血压和体液的调节以及新血管的生成,可作为血管生成的生物标记物。现阶段检测AGT的方法有限,尤其利用生物传感技术检测AGT的研究少之又少。构建基于G-四链体检测AGT的生物传感器是很有前景的,G-四链体对血管生成的影响值得深入研究。本论文构建免标记G-四链体荧光探针。筛选出可以与AGT结合的易于进入细胞的G-四链体,并进行G-四链体与AGT的相互作用的表征。荧光信号的读取方式通用性较强,探究基于G-四链体的“点亮”型荧光探针作为传感器的信号读取方法,建立基于G-四链体的荧光体系。构建根据其优良异性设计TPE/G-四链体探针。卟啉化合物NMM能与G-四链体特异性结合产生强荧光,基于这一特异性设计NMM/G-四链体探针。两种“点亮”型荧光探针成功构建,经过调试和优化检测AGT,静电作用和G-四链体的空间构象可以检测蛋白,但不具有良好的特异性。本论文利用磁珠富集法基于G-四链体检测AGT。利用抗原-抗体结合的原理,链酶亲和素磁珠捕获生物素修饰的核酸,G-四链体与AGT结合,AGT与对应一抗结合。荧光标记的二抗实现对一抗的检测,从而间接检测磁珠富集的AGT。G-四链体(C20-4 min)可以专一特异的定量检测AGT,与ELISA方法检测限相同约为5×10-5mg/m L(S/N=3)。利用免疫沉淀法实现了细胞水平上基于G-四链体检测AGT。本论文探究G-四链体对血管生成的影响。AGT是血管生成的标志物,G-四链体不仅可以作为生物传感器的识别元件,也被证明在某些生物学过程剧具有重要影响。模拟体外血管生成,6 h有管状生成迹象,12 h血管凋亡。C20-4 min这种G-四链体可抑制血管生成,抑制率约为22%。这将对血管生成相关疾病有潜在的治疗作用。综上所述,本课题基于荧光信号读取方式,开发一种可靠、高效的G-四链体生物传感器用于检测AGT。通过模拟体外血管生成实验证明G-四链体对血管生成具有抑制作用,可作为治疗血管生成相关疾病的潜在药物。G-四链体有望成为血管生成相关疾病的诊疗一体化的探针。
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