论文部分内容阅读
背景及目的骨关节炎（osteoarthritis,OA）是最常见的关节退行性病变,其病理改变常常表现为关节中软骨组织的不规则缺损,软骨下骨的硬化增厚,骨皮质逐渐增厚,骨小梁大面积重塑以及关节边缘有骨赘形成等。目前,虽然已有大量的研究证明软骨细胞（articular chondrocytes,AC）及软骨下骨祖细胞（subchondral osteoprogenitor cells,SBPC）间存在着跨越钙化软骨层及皮质层这一物理分隔的逐级调控机制,但是具体的逐级调控顺序及其中的关键信使尚未明确。本研究旨在探究软骨及软骨下骨间逐级调控的顺序及其间的关键信使,并明确其对骨关节炎的发展产生的影响,以期开发其作为治疗OA的新疗法靶点。方法及结果第一部分:OA中软骨细胞与软骨下骨祖细胞两细胞间的相互作用关系研究研究方法:（1）切断前交叉韧带法制备兔OA模型;（2）分别提取并鉴定健康新西兰大白兔与OA新西兰大白兔的AC及SBPC,并传代培养;（3）CCK-8实验分别检测骨关节炎模型中软骨下骨祖细胞（OA-SBPC）及正常软骨下骨祖细胞（N-SBPC）细胞的增殖能力;（4）使用Western Blot及免疫荧光染色方法检测N-SBPC/OA-SBPC的成骨分化相关蛋白表达;（5）将AC与SBPC在Transwell中进行交叉共培养;（6）实验中,使用Western Blot检测方法和实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测方法同时检测Transwell下室SBPC的成骨分化相关蛋白（ALP,Co L-1,BSP及Runx-2）及基因表达和AC的Aggrecan,Co L-2,Sox-9相关蛋白及基因表达。实验结果:（1）成功制备了兔OA模型并分离提取健康新西兰大白兔与OA新西兰大白兔的AC及SBPC;（2）CCK-8实验证明OA中SBPC的增殖能力较N-SBPC明显增强;（3）相较于N-SBPC,OA-SBPC的ALP,Co L-1,Runx-2表达明显升高,BSP表达降低;（4）OA-AC可以诱导N-SBPC向OA-SBPC方向转变,而OA-SBPC和N-SBPC对N-AC未见明显影响。结论:我们成功制备了兔OA模型,并分别分离提取了健康兔与OA兔的AC和SBPC。结果显示,OA中SBPC的增殖能力和成骨能力均明显增强,但是矿化能力降低。更有趣的是,共培养后,OA-AC可以诱导正常的SBPC向OA-SBPC表型转变。这表明在OA发展过程中软骨的改变可能在软骨下骨表型改变的上游,即软骨细胞先出现改变后进一步影响了软骨下骨的细胞表型异变和病理改变。第二部分:探索软骨细胞调控软骨下骨细胞表型改变的关键信使研究方法:（1）超速离心法收集OA-AC和N-AC分泌的外泌体及细胞因子;（2）透射电镜观察所提取的沉淀物形态特征,Western blot方法检测其表面特异性蛋白;NTA进一步检测外泌体的纯度以及浓度;（3）CCK-8实验检测细胞增殖能力改变、Western blot及q RT-PCR同时检测外泌体对N-SBPC表型变化的影响。实验结果:（1）电镜下观察到所提取出的沉淀物具备外泌体形态学特征,且WB检测CD9和TSG101表达均为阳性;同时NTA检测也显示本实验条件下所提取的外泌体粒径集中于40-100nm之间,提示所提取的外泌体纯度较高;（2）分别加入上述外泌体及细胞因子处理后,结果显示OA-AC-exo可显著促进N-SBPC增殖能力,使其成骨特异性蛋白及基因表达明显升高,但BSP表达降低。结论:我们成功从两种软骨细胞培养的上清液中分离提取了了外泌体及细胞因子。在体外实验中,我们发现OA-AC来源的外泌体可以促进SBPC增殖能力和成骨能力,但是会降低其矿化能力。这证明了OA-AC来源的外泌体很可能是软骨细胞介导软骨下骨祖细胞表型改变的关键信使。第三部分:体内实验探索OA-AC源性外泌体对兔膝关节病理软骨下骨表型的影响研究方法:（1）使用手术方法在兔膝关节股骨内髁下方钻孔后将获取的OA-AC-exo/N-AC-exo/PBS(外泌体浓度:1010/m L)分别注入;（2）术后12周时分批处死实验动物,取材进行组织学染色及软骨下骨表面积定量分析。实验结果:（1）OA-AC-exo组软骨下骨表面积及软骨下骨/软骨+软骨下骨+骨小梁（表面积）%明显增高,且存在统计学差异（P＜0.05）,其余2组无明显差异;（2）Goldner染色结果显示OA-AC-exo组软骨下骨层明显增厚,软骨下骨组织增生并伴有软骨下骨层明显增厚。结论:体内实验再次验证,OA-AC来源的外泌体可以促进正常SBPC向OA-SBPC转化,与上文所述体外实验结果统一且符合骨关节炎软骨下骨病理特征,进一步从动物实验明确了OA-AC-exo促进软骨下骨的病理改变。小结1、OA中SBPC的增殖能力和成骨能力均明显增强,但是矿化能力降低;2、OA-AC可以诱导正常的SBPC向OA-SBPC表型转变;3、OA-AC来源的外泌体可以促进SBPC增殖能力和成骨能力,但是会降低其矿化能力;4、OA-AC-exo处理后软骨下骨表面积及软骨下骨/软骨+软骨下骨+骨小梁（表面积）%明显增高。