论文部分内容阅读
临床验方是创新中药研发的源泉,口服汤剂是名医验方的主要给药方式与特色,多糖是汤剂的物质基础之一。肠康方(由熟地黄、菟丝子、白芍、黄连、防风和金荞麦等组成)是全国名老中医王德明主任医师治疗腹泻型肠易激综合征(IBS-D)近30年的临床验方,疗效显著且副作用小。本文针对基于肠康方创新药研发过程中如何系统评价多糖组分对肠康方治疗IBS-D的效应贡献的问题,开展了四个方面的研究。(一)采用 UPLC-QTOF-MS/MS、HPLC-PDA、HPGPC-ELSD 及 UV-Vis 技术对肠康方的小分子和多糖组分进行系统表征。通过特征裂解途径解析以及对照品比对从肠康方中鉴定了 22个小分子成分,主要为生物碱、单萜苷、色原酮及环烯醚萜苷类。同时首次建立了其中16个主要成分的UPLC-QTOF-MS/MS定量分析方法,该方法具有良好的线性、灵敏度、精密度、稳定性和准确度,且基质干扰小,适用于成分定量分析。肠康方中含量较高的小分子成分是芍药内酯苷(14634.53±940.58 μg/g)和芍药苷(9683.27±682.88μg/g),其次为没食子酰芍药苷(2099.55 ± 262.11μg/g),小檗碱(1524.28±72.13 μg/g)等。肠康方的总多糖含量约为6.65%(生药量),多糖分子量分布范围是1.00-21696.7 kDa,其单糖组成主要有甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara),摩尔比为5.82:1.00:21.13:9.29:1.17。与分煎混合液相比,传统合煎液中单萜苷、生物碱类成分含量较低,而总多糖含量相对较高,这可能与合煎过程中多成分络合作用有关。由此可见,不同的煎煮方式会导致肠康方成分的较大差异。(二)采用基于UPLC-QTOF-MS/MS技术的血清药物化学方法比较肠康方提取物(多糖+小分子组分,CKF)和肠康方小分子组分(CKFSM)在正常大鼠(Con)和伪无菌大鼠(ABX)体内的血中移行成分。结果表明,CKF和CKFSM给药后的入血移行成分均为肠康方中主要成分,如芍药苷、木兰花碱、巴马汀和小檗碱等。这些成分入血后呈现经时动态变化,在CKFSM组普遍于0.25-0.5 h达到响应峰值,随后迅速清除,于2-4 h二次达峰,这些变化与化合物的结构特性(芍药苷、小檗碱等均为p-糖蛋白底物,升麻素苷易被代谢为苷元升麻素)、分布特征(小檗碱组织分布广泛)以及机体的代谢特点(肠肝循环)密切相关,反映了不同结构的成分在体内吸收代谢的差异。与CKFSM组相比,CKF组各类成分的入血响应具有显著差异,芍药苷、升麻素苷的入血响应显著低于CKFSM组和ABX组,提示多糖可能通过调节肠道菌群组成而影响此类成分的肠内代谢转化,从而降低体内暴露水平。而小檗碱、巴马汀在0.25 h的入血响应却显著高于CKFSM组,提示多糖的存在可能抑制p-糖蛋白(p-gp)表达、发挥天然药物载体作用,促进巴马汀、小檗碱等小分子成分的体内吸收,加快肠肝循环,延迟排泄进程,延长复方整体疗效。(三)利用网络药理学方法对前期血清药化结果进行通路网络分析,选择CKF组和CKFSM组建立随时程变化的“入血成分-靶点-IBS-D-通路”网络,挖掘关键靶点及通路差异,并结合IBS-D病症特点进行关联分析。结果表明,两种药液给药后的入血原型成分、关联靶点及优势通路均发生经时动态变化,且入血4 h内的优势通路均为神经活动配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)和癌症通路(Pathways in cancer),其机制与激活神经元分化和炎症反应密切相关。而两组的次要通路在各个时间点的先后顺序则有所不同,使得优势效应产生差异。随着入血时间的推移,CKFSM组的优势效应由镇痛和维持肠道内稳态到改善肠上皮屏障功能,再到缓解炎症疼痛,调节肠道通透性。与CKFSM组相比,CKF治疗IBS-D的内在通路则从最初的调节肠道通透性到修复肠道屏障功能,再到缓解炎症疼痛,以及抗氧化、维持肠道稳态。CKF组EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、Gap junction 等通路较 CKFSM 组作用突出,能够更好地改善肠道屏障功能、提前发挥调节肠道细胞内稳态作用,且作用持久。由此可知,多糖组分的存在对于肠康方改善肠道屏障功能、维持肠道稳态、缓解胃肠症状方面具有突出贡献。(四)利用番泻叶灌胃联合束缚应激方法建立经典IBS-D大鼠模型,以腹壁撤退反射评分(AWR)、粪便性状评分、粪便颗粒评分和粪便含水量为药效指标,探索CKF与CKFSM治疗IBS-D的药效差异,并进一步基于16S rRNA测序技术对大鼠粪便进行肠菌多样性差异研究,同时利用基于UPLC-QTOF-MS/MS技术的脂质组学方法对大鼠大脑样本中的脂质代谢物进行分析,考察多糖组分对肠康方治疗IBS-D药效影响的内在机制。结果表明,CKF和CKFSM均能显著改善IBS-D大鼠的内脏高敏感症状,且CKF相较于CKFSM更能改善腹泻症状,提示多糖的存在具有促进整体药效的作用。肠道菌多样性研究和脂质代谢组学结果表明,与正常组相比,IBS-D大鼠体内的肠菌多样性和比例发生显著改变,表现为厚壁菌门丰度的增加和拟杆菌门丰度的降低,同时IBS-D大鼠的脑内脂质代谢轮廓也发生显著变化,32个潜在生物标志物的相对丰度变化呈现异常趋势。在CKF和CKFSM治疗后,肠菌丰度和脂质代谢物水平得到明显改善,两组均能在肠菌调节方面有效增加有益菌普拉梭菌(Faecalibacterium)丰度,显著降低萨特氏菌(Sutterella)等致病菌的相对丰度,并且在脂质代谢方面有效调节磷脂酰胆碱和甘油三酯的相对丰度。此外,有趣的是,两组对菌群调节和脂质代谢作用具有各自的偏向性,CKFSM能够更大程度地回调乳酸杆菌(Lactobacillus)以及致病菌萨特氏菌(Sutterella)、普雷沃氏菌(Prevotella)等丰度异常趋势,同时突出回调鞘糖脂和鞘磷脂水平,有效调节鞘脂代谢,在改善肠道炎症反应和镇痛作用方面具有优势作用;而CKF更倾向于提升Collinsella、Bacteroides的丰度,促进黏液降解菌瘤胃球菌(Ruminococcus)、粪异杆菌(Allobaculum)等多种致病菌丰度的降低趋势,同时有效回调酰基肉碱、异戊烯醇脂质(Lactapiperanol C)等代谢物,调节甘油磷脂代谢、脂肪酸降解等通路,发挥抗氧化、抗焦虑作用,这提示多糖组分的参与具有调节更多菌群,恢复宿主免疫功能和屏障完整性、调节能量代谢以及抗氧化等多方面作用。这些结果与网络通路分析结果部分契合,能够验证多糖组分的存在对于肠康方改善肠道屏障功能、维持肠道稳态、缓解胃肠症状方面的突出贡献,肠菌介导和脂质代谢调控可能是多糖组分影响肠康方整体药效的机制。综上,多糖组分是肠康方的主要活性成分之一,能够显著影响小分子组分的血中移行的动态变化趋势,使得肠康方治疗IBS-D的优势通路网络发生改变,从而引起药效差异,其潜在机制与肠菌介导和脂质代谢调控密切相关。多糖组分的存在可以调节有益菌Collinsella和黏液降解菌Ruminococcus丰度,回调酰基肉碱、Lactapiperanol C等脂质代谢物水平,影响入血小分子成分的吸收代谢,发挥EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、Gapjunction等通路优势作用,促进全方改善肠道屏障功能、维持肠道稳态的功效。基于上述结果,可以得出结论:多糖组分对肠康方治疗IBS-D功效具有重要贡献,在后续制剂工艺中应当保留多糖以确保肠康方疗效。本研究为肠康方的工艺研究和质量控制提供了科学依据,也为其他基于名医验方的创新药研发过程中多糖组分的药效贡献研究提供了新思路。