目的:最近发现非编码区基因突变,翻译后蛋白异常剪接、修饰是肿瘤新生抗原的主要来源,这导致基于全外显子测序的肿瘤新抗原预测的准确性极低,限制了新抗原的临床应用。本研究通过免疫磁珠沉淀、液相色谱联合质谱技术,结合全外显子测序,直接检测人肿瘤细胞及其来源的正常细胞,获取癌细胞独有的,而正常细胞没有的八至十一肽,剔除其中的污染肽。进一步地,通过生物信息分析软件,确定筛选出的各肽与其来源患者的HLA-Ⅰ分子等位基因的结合亲和力、结合稳定性;根据各肽的结合亲和力、结合稳定性,发现其中部分能够通过HLA-Ⅰ类分子递呈的新抗原肽。随机抽取上述筛查前后的肽,通过体外免疫学实验确定筛查前后的免疫活性的变化,并通过T细胞受体（TCR）免疫组库技术检测新抗原肽活化的TCR的变化,鉴定所发现的有免疫活性的新抗原肽,从而证实我们研发的新抗原筛选管线的准确性和有效性。方法:1.肿瘤细胞独有八至十一个氨基酸残基新抗原肽信息获取:收集癌症患者肿瘤细胞及其来源癌旁组织正常细胞,免疫磁珠沉淀获pMHC复合物,结合液相色谱联合质谱技术进行检测,获取癌细胞独有新抗原肽,保留长度为八至十一个氨基酸残基新抗原肽,剔除污染肽（包括残基数不到8或超过11的肽,锚定点或残基序列明显不符新抗原肽特性的肽,以及肽突变残基不与CDR3结合的肽）,初筛获得肽段长度为八至十一个氨基酸残基的4种肿瘤新抗原肽。2.全外显子测序获取患者HLA-Ⅰ分子等位基因及新抗原肽预测:对质谱检测的肿瘤细胞进行全外显子测序,生物学信息分析获取来源患者的HLA-Ⅰ分子的等位基因分型及全外显子测序预测的新抗原肽。3.HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽的预测:由NetMHC-4.0、NetMHCstabpan-1.0软件分别查获质谱检测所得肿瘤新抗原肽与各肽来源的HLA-Ⅰ分子等位基因的IC50值、pMHC复合体的预计半衰期值。IC50值＜500nm为肿瘤新抗原肽与HLA-Ⅰ分子结合亲和力较高,pMHC复合体的预计半衰期＞1小时为肿瘤新抗原肽与HLA-Ⅰ分子结合较稳定。参照同类研究,将IC50值＜500nm,且pMHC复合体的预计半衰期＞1小时设定为能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽。对经上述筛选前、后的新抗原肽进行体外免疫活性实验验证。4.ELISPOT实验体外免疫原性检测:获取标本来源患者外周血,Ficoll密度梯度离心法获取PBMC体外培养,用等质量的新抗原肽诱导分化为成熟DC细胞,与新鲜PBMC共培养,酶联免疫学斑点计数检测体外免疫学效应。5.TCR免疫组库测序:随机选取部分预测能或不能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽,用等质量肿瘤新抗原肽将PBMC诱导分化为成熟DC细胞,与新鲜PBMC共培养,T细胞免疫组库测序技术检测两组新抗原肽刺激前后TCR-β链变化。6.统计学分析:ELISPOT检测所获得的T’及T细胞免疫组库测序所获得克隆总数、Clonality值等用SPSS 26软件进行独立样本t检验,设定P＜0.05为具有统计学意义。结果第一部分:成功获取正常组织没有而肿瘤细胞独有的八至十一肽的新抗原肽:通过免疫磁珠沉淀法结合液相色谱联合质谱技术检测四例不同肿瘤患者的肿瘤细胞及其来源癌旁组织正常细胞,共检测到5338条肽段,癌细胞独有的新抗原肽共650条,其中污染肽共165条,占比25.38%,剔除后获得长度为八至十一个氨基酸残基的4种肿瘤新抗原肽共485条,其中九肽最多,共57.32%。第二部分:1.根据四例患者的全外显子测序生物信息学分析,成功获取每位患者的HLA-Ⅰ分子等位基因型,具体结果见表3。2.由NetMHC-4.0软件查获质谱检测的肿瘤新抗原肽与各肽来源患者的HLA-Ⅰ分子等位基因的IC50值。据此确定了 485条新抗原肽与HLA-Ⅰ分子的亲和力大小。3.由NetMHCstabpan-1.0软件查获质谱检测的肿瘤新抗原肽与各肽来源患者的HLA-Ⅰ分子等位基因的pMHC复合体的预计半衰期。据此确定了 485条肿瘤新抗原肽与HLA-Ⅰ分子结合稳定性数据。4.将IC50值＜500nm,且pMHC复合体的预计半衰期＞1小时设定为能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽。从485条肿瘤新抗原肽中共筛选出被有效递呈的肽共135条。5.根据目前常用的全外显子测序预测获得275条新抗原肽,其中仅2条出现在上述485条肿瘤新抗原肽里,仅1条出现在上述135条肽里。第三部分:1.利用Ficoll密度梯度离心法体外成功制备混合DC疫苗。2.ELISPOT体外免疫活性检测结果:1)对所预测与HLA-Ⅰ分子结合亲和力较高组和较低组的肿瘤新抗原肽的T’值进行独立样本t检验,结果P＜0.001,差值具有统计学意义,表明与HLA-Ⅰ分子结合亲和力高的新抗原肽免疫活性较强;2)对所预测与HLA-Ⅰ分子结合较稳定组和结合较不稳定性组肿瘤新抗原肽的T’值进行独立样本t检验,P＜0.001,差值具有统计学意义,表明与HLA-Ⅰ分子结合较稳定的肿瘤新抗原肽免疫活性较强;3)对所预测的能或不能被HLA-Ⅰ分子有效呈递组的肿瘤新抗原肽的T’值行独立样本t检验,P＜0.001,差值具有统计学意义,表明能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽的免疫活性较强。3.TCR β链免疫组库测序结果:1)对所预测能或不能被HLA-Ⅰ分子有效呈递组的新抗原肽刺激后检测T细胞受体β链后所得的克隆总数变化百分比进行独立样本t检验,P=0.018,差值具有统计学意义,同时对两组抗原肽刺激前后Clonality变化进行独立样本t检验,P=0.007,差值据有统计学意义。与不能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽相比,能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽更能刺激TCR发生克隆性增殖,证实利用HLA-Ⅰ分子结合亲和力、结合稳定性筛选出来的由HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽为免疫有效的新抗原肽。2)获得了所预测能或不能被HLA-Ⅰ分子有效性递呈的肿瘤新抗原肽刺激后TCR-β链的V-J基因重排结果。3)获得了肿瘤新抗原肽刺激后TCR β链的CDR3长度分布,发现肿瘤新抗原肽刺激后TCRβ链的CDR3长度范围在40-50bp所占的比例最高。4)获得了所预测的能或不能被HLA-Ⅰ分子有效呈递的肿瘤新抗原肽刺激后TCR-β链克隆性蜗牛图,能被HLA-Ⅰ有效呈递的肿瘤新抗原肽刺激后所得TCR β链测序数据中可被测得3次以上的TCR克隆序列、前20%TCR克隆序列较空白对照组增加,预测不能被HLA-Ⅰ有效呈递肿瘤新抗原肽刺激后所测的3次以上的TCR克隆序列、前20%TCR克隆频率较其对应的空白对照组降低。结果表明所预测能被HLA-Ⅰ有效呈递的肿瘤新抗原肽为免疫有效的新抗原肽。结论:第一,免疫磁珠沉淀法结合液相色谱联合质谱技术可以初步筛选肿瘤细胞独有的HLA-Ⅰ分子结合的新抗原肽,但污染肽占比较高;加大质谱检测深度可以减少新抗原肽的遗漏,但可能增加污染肽占比。第二,新抗原肽与HLA-Ⅰ类分子的结合亲和力、结合稳定性,可用于简捷、有效地筛选出免疫活性较强的新抗原肽。第三,TCR免疫组库测序可用于评估新抗原肽刺激前后TCR免疫组库的动态变化,证实新抗原肽的免疫学效应和免疫特异性,有助于预测个体化肿瘤疫苗治疗效果。第四,仅据全外显子测序预测肿瘤新抗原肽,准确性极低,临床应用价值有限。第五,免疫磁珠沉淀法、液相色谱联合质谱技术、全外显子测序,ELISPOT技术和TCR免疫组库测序相互结合,可以形成一条针对真实存在的免疫有效新抗原肽的准确的筛选管线。