多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs）是一类常用的添加型溴代阻燃剂,属于广泛暴露在环境、动植物及人体内的一种持久性有机污染物。其中,十溴联苯醚（BDE-209）作为PBDEs的主要同源物,仍在一些亚洲国家生产和使用,对环境造成广泛污染。畜禽在人类食物来源中占很大比例,近年来多次在鸡肉、鸡蛋等畜禽产品中检测出BDE-209的残留。然而,有关BDE-209在肉鸡可食性组织的蓄积残留特性和毒代动力学信息却鲜有报道。为了填补这一空白,本文研究单剂量暴露下BDE-209在可食性组织和血液中的分布特征和蓄积残留特性,摸清PBDEs在肉鸡体内的迁移和蓄积规律,为养殖业中PBDEs的污染防控提供重要依据。基于代谢残留实验结果,BDE-209在肝脏中的残留较高,推测具有潜在的肝毒性,结合BDE-209主要在肝脏发生代谢反应的特性,故开展BDE-209对肝脏损伤的影响及作用机制的研究对保护畜禽健康具有十分重要的意义。近年来,BDE-209对畜禽危害的研究主要集中在内分泌和神经系统,国内外关于BDE-209暴露对肝脏毒性作用的研究较少,诱导肝脏损伤发生机制亦无明确定论。因此,本研究采用BDE-209标准品,观察不同浓度BDE-209处理后,肉鸡血液生化指标、组织病理切片和抗氧化等方面的变化,揭示BDE-209对肉鸡的临床毒性效应。为进一步探究BDE-209诱导肉鸡肝脏损伤的发生机制,通过肝脏转录组学测序分析不同剂量BDE-209处理后肉鸡肝脏损伤的分子机制,挖掘与损伤相关的候选基因和信号通路。此外,还采用Real-time PCR和Western blot的方法,从基因和蛋白水平验证BDE-209诱导肉鸡肝脏损伤的作用机制。本试验主要研究内容和研究结果如下:1.BDE-209在肉鸡可食性组织中的生物蓄积特性和毒代动力学研究本研究旨在探索BDE-209对肉鸡血液毒代动力学、可食组织蓄积动力学和组织残留的影响。选用30日龄,体重相近的雄性肉鸡120只,随机分为15个组,每组设8个重复,对照组灌胃等量玉米油,试验组单剂量灌胃25 mg/kg溶解在玉米油中的BDE-209。结果显示,气相色谱法测量血液,肝脏,腿肌,胸肌和其他组织器官中的BDE-209浓度,用单室模型分析的血液中BDE-209浓度的变化,血液中BDE-209浓度在24小时达到峰值,半衰期为168.28小时,4周后BDE-209的痕量水平为2.755ng/m L;可食用组织肝脏中的Cmax（443.80 ng/g）远高于腿肌（58.78 ng/m L）和胸肌（95.33 ng/m L）,肝脏和肌肉的Tmax分别为12和24小时;在不同组织器官都检测到BDE-209残留,其浓度排序如下:脂肪﹥肝﹥胸腺﹥心脏﹥睾丸﹥大腿肌肉﹥皮肤﹥肺﹥肾脏﹥胸肌﹥胸肌﹥脾脏。结果表明,BDE-209吸收不良,肝脏比起肌肉承担更大的BDE-209污染的负担。此外,BDE-209可以渗透到脂肪、肾脏、心脏、肝脏和肌肉等各种组织中,不同组织中BDE-209的出现和相对丰度可能取决于组织脂质含量和血液中BDE-209的组织灌注率。2.BDE-209在肉鸡肝脏中的蓄积及对肝脏损伤相关指标的影响本研究旨在探索不同浓度BDE-209处理在肉鸡肝脏中的残留,以及对检测肝脏残留、肝脏组织病理、炎症、血液生化及抗氧化等指标的影响。随机选取1日龄,体重相近的雄性AA肉鸡120只,随机分为4个组,每组设3个重复,每个重复10只鸡。对照组每天给予标准基础日粮,其他三组在基础日粮中分别添加0.004、0.04和0.4g·kg-1 BDE-209,持续6周。结果显示,BDE-209作用下,0.4和4.0 g·kg-1 BDE-209处理组肝脏组织中的BDE-209浓度显著增加;在0.4和4.0 g·kg-1 BDE-209组肝脏组织中多见炎性细胞浸润、肝细胞水肿和胞质疏松、出现巨细胞核等。血液生化指标显示较对照组相比,0.04 g·kg-1 BDE-209组ALT明显升高,0.4 g·kg-1 BDE-209组ALT、AST及GGT水平显著升高。肝脏氧化应激指标显示0.04和0.4 g?kg-1BDE-209组血液SOD和CAT活性降低,0.04和0.4 g?kg-1 BDE-209组MDA,SOD浓度升高。肝脏炎症指标显示0.04和0.4 g?kg-1 BDE-209组中促炎因子IL-1、IL-1β和TNF-α的含量显著提高,抗炎因子IL-4的含量显著下降,结果表明,BDE-209对肉鸡肝脏具有毒性作用,中高剂量BDE-209暴露会诱导炎症发生和氧化应激,此外,病理变化中的炎症细胞浸润阐明BDE-209诱导肉鸡肝脏发生炎症反应,这可能是BDE-209诱发肝脏毒性的关键途径之一。3.BDE-209诱导肉鸡肝脏的转录组学变化动物饲养试验结束后,收集各试验组的肝脏组织,进行RNA-Seq分析、差异表达基因GO功能富集和KEGG信号通路分析。结果显示,每个样品所得的测序比对鸡参考基因组,比对率均在92%以上,Q20、Q30含量分别在97%、93%以上;低剂量组和高剂量组与对照组相比分别筛选到78、769个差异表达基因,其中低剂量组44个基因表达上调,34个基因表达下调,高剂量组156个基因表达上调,613个基因表达下调。低剂量组GO功能主要在RNA磷酸二酯键水解,核内水解、DNA整合、嘌呤碱基代谢过程等生物学过程显著富集;KEGG通路显著富集到40条通路,富集到淀粉和蔗糖代谢、氨酸代谢、氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解、神经活性配体-受体相互作用信号通路等,主要影响肉鸡的体内的代谢。高剂量组GO功能主要在细胞周期过程,核分裂、DNA整合、有丝分裂姐妹染色单体分离等生物学过程显著富集;KEGG通路显著富集到108条通路,涉及细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用、用于生成Ig A的肠道免疫网络、钙信号通路,p53信号通路、Wnt信号通路和MAPK信号通路等。筛选到WNT5A、FZD2、PLCB2D、PRKCB、CAMK2D、PPP3CA、NFATC1、MAPK11、IL-R、MAPK8、WNT4、CTNNB1、TCF7和WISP1富集到Wnt信号通路和MAPK信号通路上。结果表明,不同浓度BDE-209诱导肉鸡肝脏基因表达差异,高剂量下的差异更显著,提示基因表达异常是肝脏损伤发生的重要原因;挖掘出与肝脏损伤炎症相关的Wnt,MAPK通路和参与其中的关键基因,为深入研究肝脏损伤机理提供参考。4.BDE-209对肉鸡Wnt和MAPK信号通路相关基因表达的调控作用利用real-time PCR和Western-blot验证RNA-Seq测序数据,QRT-PCR法验证肉鸡肝脏WNT5A、FZD2、PLCB2D、PRKCB、CAMK2D、PPP3CA、NFATC1、MAPK11、IL-R、MAPK8、WNT4、CTNNB1、TCF7和WISP1的m RNA表达水平变化,以及Western Blot验证各组肉鸡肝脏组织WNT5A、β-catenin、P38、P-P38、P-JNK、JNK、P-ERK、ERK、NF-κB蛋白表达水平。结果显示,14个随机选择的差异表达基因的表达趋势与RNA-Seq结果一致。Western Blot结果显示当BDE-209剂量处于0.4 g·kg-1时,肉鸡肝脏内p-JNK、p-ERK、Wnt5a的表达水平显著上升。此外,低剂量组和高剂量组(0.004,0.4 g?kg-1)鸡肝脏组织经BDE-209作用后与对照组相比,NF-κB与β-catenin蛋白表达水平均显著升高。结果表明,不同水平BDE-209可能通过调控肝脏组织相关基因以及蛋白的表达,作用于Wnt信号通路和MAPK信号通路,参与BDE-209对肝脏的毒性作用,诱导炎症发生,引起肝脏损伤。综上所述,根据毒物动力学信息,BDE-209在口服单次给药后会迅速通过系统循环吸收。然而,在观察期内,BDE-209的吸收量并没有从肝脏或肌肉组织中清除,肝脏更有可能承担BDE-209的暴露风险。此外,BDE-209可以渗透到各种组织,如脂肪、肾脏、心脏、肝脏和肌肉组织中,BDE-209在不同组织中的蓄积能力可能由组织脂质含量和BDE-209在血液中的组织灌注率所决定。此外,BDE-209暴露会导致转录谱和肝功能的变化,并通过氧化应激和炎症反应引起肉鸡的肝损伤。结合转录组结果可知BDE-209所致肝毒性可能与其作用于Wnt信号通路和MAPK信号通路,诱导炎症反应、氧化应激等过程有关。