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羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（OrfVirus,OrfV）引起的一种接触性、嗜上皮性人兽共患传染病。OrfV主要感染绵羊和山羊,羔羊的发病率可高达90%～100%,主要特征病变为口唇、鼻部等处形成增生性损伤,是危害养羊业的重要传染病。OrfV为痘病毒科（Poxviridae）、副痘病毒属（Parapoxvirus）成员,为有囊膜线性双股DNA病毒。F1L蛋白为病毒表面囊膜蛋白,研究发现F1L蛋白具有肝素结合活性,与病毒吸附和侵入宿主细胞有关,在病毒感染早期阶段起作用。羔羊睾丸（Lamb testicular,LT）细胞是OrfV增殖的敏感细胞,细胞膜表面或细胞内必定存在其相互作用蛋白。因此,筛选、鉴定OrfV F1L蛋白与宿主细胞互作的蛋白对解析病毒致病机制具有重要意义。本研究拟构建羔羊睾丸细胞酵母双杂交c DNA文库和OrfV F1L蛋白诱饵菌株,采用酵母双杂交技术筛选与OrfV F1L蛋白互作的宿主细胞蛋白,进一步采用回复杂交、免疫共沉淀（Co-IP）、His-Pull down对F1L蛋白与宿主细胞互作蛋白进行验证,激光共聚焦显微镜观察F1L蛋白与宿主细胞互作蛋白在细胞内的共定位。为探究OrfV的致病机制奠定基础。1.羔羊睾丸细胞酵母双杂交c DNA文库的构建及鉴定该试验旨在构建羔羊睾丸细胞酵母双杂交c DNA文库,并对其文库质量进行评价。采集羔羊睾丸制备LT细胞,稳定传代后利用TRIzol法提取LT细胞总RNA,对总RNA的浓度及纯度进行检测,运用SMART技术合成全长c DNA,通过同源重组的方法将p GADT7-Rec载体与c DNA共转化至Y187酵母感受态细胞,经营养缺陷型选择性培养基（SD/-Leu）筛选阳性克隆以构建c DNA文库,并对文库滴度、总容量、重组率及插入片段进行检测。结果显示,成功制备LT细胞,构建了LT细胞酵母双杂交c DNA文库,经检测文库滴度为2.33×10~8CFU·m L-1,文库总容量达3.5×10~9CFU,文库重组率为100%,插入片段长度主要集中在250～2 000 bp。结果表明,构建的LT细胞c DNA文库质量良好,可用于后续酵母双杂交筛选。2.羊口疮病毒F1L蛋白诱饵菌株的构建及鉴定该试验旨在构建OrfV F1L蛋白诱饵菌株。提取Orf病料DNA,PCR扩增F1L基因,将其克隆至p MD18-T载体,经PCR、双酶切以及测序鉴定,获得p MD18-T-F1L克隆质粒;将p MD18-T-F1L克隆质粒和p GBKT7载体同时经限制性内切酶Eco RⅠ和NcoⅠ酶切后,连接转化至DH5α感受态细胞以构建诱饵质粒p GBKT7-F1L;采用PEG/Li Ac方法将p GBKT7-F1L诱饵质粒转化至Y2H Gold酵母感受态细胞,通过Western-Blot鉴定诱饵蛋白在酵母细胞中是否正确表达,再经SD/-Trp/-Leu（DDO）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（QDO）选择性培养基检测其自激活活性,同时测定诱饵菌株与空载体菌株在不同时间段的OD600 nm,对比两者生长曲线差异以检测诱饵蛋白是否有细胞毒性。结果显示,扩增出F1L基因大小为1 029 bp,成功构建p GBKT7-F1L诱饵质粒,及p GBKT7-F1L/Y2H Gold诱饵菌株。经Western-Blot验证表达的诱饵蛋白大小约为61 k Da,同时经DDO、QDO选择性培养基检测诱饵蛋白无自激活活性,OD600 nm测定诱饵菌株生长曲线显示诱饵蛋白无毒性作用。结果表明,本试验成功构建OrfV F1L蛋白诱饵菌株,满足后续双杂交筛选试验条件。3.羊口疮病毒F1L蛋白与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定该试验旨在筛选及鉴定在LT细胞上与OrfV F1L蛋白互作的细胞蛋白。将LT细胞c DNA文库与p GBKT7-F1L/Y2H Gold诱饵菌株进行杂交混合培养,经QDO和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/Ab A（QDO/X/A）选择性培养基进行3次筛选,再经回复杂交、Co-IP、His-Pull down以及激光共聚焦进行互作验证。结果显示,经酵母双杂交初步筛选有57个宿主细胞蛋白与F1L蛋白相互作用;进一步通过回复杂交试验,验证与F1L蛋白互作的宿主细胞蛋白有5个,分别是:真核翻译起始复合物3i（Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I,e IF3i）、α-辅肌动蛋白4（Alpha actinin 4,ACTN4）、纤维连接蛋白1（Fibronectin 1,FN1）、基质金属蛋白酶2（Matrix metallopeptidase 2,MMP2）和半乳糖凝集素1（Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS1）;从5个蛋白中选择LGALS1与F1L蛋白进行Co-IP和His-Pull down试验,均证实LGALS1蛋白与F1L蛋白在细胞内、外存在相互作用;利用激光共聚焦显微镜观察F1L蛋白与LGALS1蛋白共定位于细胞质。结果表明,OrfV的F1L蛋白与LT细胞中的LGALS1存在相互作用。