目的：　　探讨激活转录因子4（Activating transcription factor 4，ATF4）在真菌性角膜炎中的作用及其分子调控机制。　　方法：　　本实验分别在感染真菌性角膜炎的C57BL/6小鼠动物模型及体外培养的人外周血的单核细胞系（THP-1）细胞上进行了研究。根据实验目的，我们从以下三个方面进行验证：　　1．探讨激活转录因子4在小鼠真菌性角膜炎中的表达及作用。ATF4表达实验中实验动物选择 C57BL/6 小鼠 54 只，随机挑选任意一只眼做为实验眼。在实验眼的角膜基质内注入2μL浓度为0.5×105/μL的烟曲霉菌分生孢子，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型。分别在建模后第1/2、1、2、3、5、7、10、14天拍摄角膜感染情况照片，记录不同时间点角膜感染情况，然后以颈椎脱臼法处死实验小鼠，每个时间选取小鼠6只，取实验眼及对照眼角膜用于蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）实验，检测ATF4蛋白在正常及角膜炎中角膜的表达；ATF4功能实验中实验动物选取C57BL/6 小鼠 14只，并随机分为对照组和实验组，每组 7 只。分别在建模前1天及建模前，将5μL二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（11g/L）注入对照组小鼠球结膜下预处理，将5μL ATF4激活剂（fenretinide，100μM)注入实验组小鼠球结膜下预处理。然后在小鼠角膜基质内注入2μL浓度为0.5×105/μL的烟曲霉菌分生孢子，建立两组小鼠真菌性角膜炎动物模型。于建模后第1天拍摄角膜感染照片并记录角膜感染的临床评分，一半角膜采用免疫荧光染色检测 ATF4 对中性粒细胞募集的影响，另一半角膜采用髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）检测明确ATF4激活后对中性粒细胞活化的影响。　　2．激活转录因子4调控LOX-1/JNK/IL-1β信号通路参与抗真菌感染。实验动物选取 C57BL/6 小鼠 48 只，随机分为四组，分别为对照组、角膜炎组、激活组和激活后角膜炎组，每组12只。在建模前1天及建模前，将5μL二甲基亚砜（11μg/mL）注入对照组和角膜炎组小鼠球结膜下预处理，将5μL ATF4激活剂(100μM)注入激活组和激活后角膜炎组小鼠球结膜下预处理。然后使用基质内注射法建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，在对照组和激活组小鼠角膜基质内注入 2μL 无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS），在角膜炎组和激活后角膜炎组小鼠角膜基质内注入2μL浓度为0.5×105/μL的烟曲霉菌分生孢子建立真菌性角膜炎动物模型。在建模后第1 天，于各组中随机选择 6 只小鼠的角膜用于聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR, RT-PCR）实验，检测凝集素型氧化型 LDL 受体 1（lectin-type oxidized LDL receptor 1，LOX-1）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的mRNA表达水平。另外 6 只小鼠角膜用于蛋白质免疫印迹实验，检测LOX-1、IL-1β、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及磷酸化JNK蛋白的表达；　　体外培养人外周血的单核细胞系（THP-1）细胞。使用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate，PMA）对对数生长期细胞预先刺激48小时，将THP-1细胞诱导贴壁为THP-1巨噬细胞。实验中将细胞分为四组。分别为对照组、真菌刺激组、激活组和激活后真菌刺激组。将二甲基亚砜（终浓度1.1μg/mL）加入对照组和真菌刺激组细胞培养液中共孵育4小时，将ATF4激活剂(终浓度10μM)加入激活组和激活后真菌刺激组细胞培养液中共孵育4小时。然后，将烟曲霉菌分生孢子加入真菌刺激组和激活后真菌刺激组细胞培养液中进行细胞真菌刺激，感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1。于真菌刺激4小时后，收集细胞用于聚合酶链式反应实验，检测LOX-1和IL-1β的mRNA表达水平。于真菌刺激16小时后，收集细胞用于蛋白质免疫印迹实验，检测LOX-1、IL-1β、JNK以及磷酸化JNK蛋白的表达水平。　　3．小鼠真菌性角膜炎中激活转录因子4对凋亡的影响。小鼠分组及建模方法同第2部分。建模后第1天，各组中随机选择6只小鼠角膜用于聚合酶链式反应实验，检测B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）、细胞色素C（Cytochrome C，Cyt-c）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8，Caspase-8）和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）的mRNA表达。另外6只小鼠角膜用于蛋白质免疫印迹实验，检测Bcl-2、BAX、Cyt-c以及磷酸化的Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达。　　结果：　　1．C57BL/6小鼠角膜感染烟曲霉菌后，角膜浑浊逐渐加重，渐有溃疡形成，溃疡区呈龛样甚至出现后弹力层膨出。随病程延长，炎症渐减轻，至14天时，溃疡区瘢痕愈合，并有新生血管长入瘢痕区域。蛋白质免疫印迹实验结果显示，正常角膜区域有少量ATF4蛋白表达，在感染后1/2、1天时，ATF4蛋白表达量明显减少，与正常角膜相比差异有统计学意义，表达量最低值出现在感染1天时。其后ATF4蛋白表达量逐渐增加，至第5天时达最高峰，表达量超过正常角膜，差异有统计学意义。其后至14天，ATF4蛋白表达量逐渐减少；C57BL/6小鼠感染烟曲霉菌1天后，见两组小鼠角膜浑浊，有溃疡形成。临床评分见对照组小鼠角膜临床评分高于实验组小鼠，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。对两组小鼠角膜行中性粒细胞免疫荧光染色，见对照组小鼠角膜内中性粒细胞浸润明显多于实验组小鼠。对两组小鼠角膜行髓过氧化物酶检测，对照组小鼠MPO值高于实验组小鼠，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2．ATF4调节LOX-1/JNK/IL-1β信号通路参与抵抗真菌免疫反应。各组小鼠感染烟曲霉菌1天后，聚合酶链式反应实验结果显示，角膜炎组小鼠角膜内LOX-1的mRNA 表达高于激活后角膜炎组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1β 的mRNA 表达也高于激活后角膜炎组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，角膜炎组小鼠角膜内LOX-1蛋白的表达高于激活后角膜炎组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）；角膜炎组与激活后角膜炎组两组间 JNK蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）；磷酸化JNK蛋白的表达高于激活后角膜炎组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1β蛋白的表达也高于激活后角膜炎组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）。各组细胞被烟曲霉菌刺激 4 小时后，聚合酶链式反应实验结果显示，真菌刺激组THP-1巨噬细胞内LOX-1的mRNA表达高于激活后真菌刺激组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-1β 的 mRNA 表达也高于激活后真菌刺激组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。各组细胞被烟曲霉菌刺激 16 小时后，蛋白质免疫印迹实验结果显示，真菌刺激组 THP-1 巨噬细胞内LOX-1 蛋白的表达高于激活后真菌刺激组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）；两组间JNK蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）；磷酸化JNK蛋白的表达高于激活后真菌刺激组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1β蛋白的表达也高于激活后真菌刺激组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）。　　3．ATF4在小鼠真菌性角膜炎中对凋亡的影响。各组小鼠感染烟曲霉菌1天后，聚合酶链式反应实验结果显示，角膜炎组小鼠角膜内Bcl-2的mRNA表达与激活后角膜炎组无明显差异（P＞0.05）；BAX、Cyt-c、Caspase-8、Caspase-9以及Caspase-3的mRNA表达均低于激活后角膜炎组，组间差异有统计学意义（BAX为P＜0.01， Cyt-c、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3为P＜0.05）。蛋白质免疫印迹实验结果显示，角膜炎组小鼠角膜内Bcl-2蛋白表达与激活后角膜炎组无明显差异（P＞0.05）；BAX、Cyt-c、Caspase-8、Caspase-9以及Caspase-3蛋白的表达均低于激活后角膜炎组，组间差异有统计学意义（均为P＜0.01）。　　结论：　　1．ATF4 参与角膜抗真菌免疫反应，激活 ATF4 可以减少募集至角膜的中性粒细胞数量，减轻小鼠真菌性角膜炎初期的炎症反应。　　2．激活ATF4可以抑制LOX-1/JNK/IL-1β信号通路的表达与激活，减弱抗真菌免疫信号传导。　　3．激活ATF4可以通过线粒体途径和死亡受体途径增强凋亡，在小鼠真菌性角膜炎初期发挥抑制炎症作用。