嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是目前国内外用于治疗癌症最具有前景的方法,它在复发难治性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）中的疗效令人振奋。CD19抗原是CAR-T细胞疗法治疗B系血液瘤研究中最常见的靶点。如今,自体CD19 CAR-T细胞在患者体内反应趋于稳定,为了使其能够让更多患者获得治疗,开发通用型CD19 CAR-T细胞是关键突破口之一。为了实现该策略,需要消除同种异体CAR-T细胞上的T细胞受体（TCR）以避免移植物抗宿主病（GVHD）和主要组织相容性复合物（MHC）,从而使CAR-T细胞的免疫原性最小化。在相关制备通用型CD19 CAR-T细胞研究中发现,多基因敲除效率、基因敲除安全性及功能变化依然是不可忽视的问题。人类MHC分子包含HLA I类分子与HLA II类分子,大部分研究者认为TCR与HLA I类分子是导致CAR-T细胞治疗中免疫排斥的关键,HLA II类分子的存在对治疗过程无太大影响。虽然这种情况下理论上HLA II类分子的存在不会发生排斥反应,但至今没有充分的数据支持这一说法,因此进一步研究将HLA分子全部消除对CAR-T细胞的影响具有很大意义。本课题利用一种技术上较成熟、操作简单的基因编辑技术-CRISPR/Cas9,对靶向CD19的CAR-T细胞实现多基因敲除,获得不表达TCR、HLA I类分子、HLA II类分子三大免疫排斥相关蛋白的CD19 CAR-T细胞;并采用体外杀伤与ELISA因子检测的方式对其功能进行验证。首先,通过电转LV-GFP质粒快速筛选出电转PBMC使用的最佳程序。然后,我们设计了若干条分别靶向TCR、B2M（HLA I类分子共同亚基）和CIITA（HLA II类分子转录调控因子）基因的sg RNA,分别筛选出最优序列,并将它们构建在同一个载体上,即一个可用于同时敲除TCR、HLA I类分子与HLA II类分子的敲除质粒（PX330 A-1X3-sg TRAC-1-sg B2M-3-sg CIITA2）。接着,由本实验室此前设计并保存的CD19 CAR慢病毒感染PBMC后进行敲除质粒电转染,通过流式分选技术获得HLA InullHLA IInullTCRnullCD19 CAR-T细胞。在此过程中,进行了一系列电转多基因敲除质粒转染效率优化实验。最后,为验证多基因敲除对CAR-T细胞功能是否有影响,我们从细胞杀伤肿瘤的能力与杀伤后因子分泌情况两方面开展试验。将获得的细胞设置不同效靶比,对CD19抗原阳性表达细胞Raji与阴性细胞K562进行体外杀伤实验,分析杀伤结果并取杀伤后细胞上清检测IFN-γ因子分泌情况。以上系列实验结果显示,本研究使用的g RNA序列可成功切割基因组打靶位点（T7E I酶切与基因组测序鉴定）,且均未出现我们顾虑的脱靶效应（对预测脱靶位点区域进行测序）。本研究最终获得的HLA InullHLA IInullTCRnullCD19 CAR-T细胞可在体外成功杀伤Raji细胞并释放细胞因子IFN-γ,而对K562细胞未见明显杀伤作用且未检出因子分泌。综上所述,我们成功建立了一种快速经济用于制备通用型CD19 CAR-T细胞的方法,并获得了可用于体外研究的通用型CD19 CAR-T细胞,以上研究成果不仅为通用型CD19CAR-T细胞新药开发开辟了新道路,同时也为通用型CAR-T细胞的开发提供了理论依据与实践基础。