【摘 要】
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研究背景:龋病主要是细菌介导的牙体硬组织慢性进行性破坏性疾病,成牙本质细胞位于牙髓的最外侧,呈高柱状紧密排列,是牙髓组织防御细菌入侵的第一道屏障。成牙本质细胞发挥其屏障功能的关键因素在于其完善的胞间连接,目前研究表明成牙本质细胞具有4种细胞连接,包括紧密连接、缝隙连接、桥粒及黏附连接。成牙本质细胞胞间连接除具有屏障功能以外,还被认为与成牙本质细胞的分化、矿化相关。在上皮细胞中,分离缺陷基因3（Pa
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:81870751）；
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研究背景:龋病主要是细菌介导的牙体硬组织慢性进行性破坏性疾病,成牙本质细胞位于牙髓的最外侧,呈高柱状紧密排列,是牙髓组织防御细菌入侵的第一道屏障。成牙本质细胞发挥其屏障功能的关键因素在于其完善的胞间连接,目前研究表明成牙本质细胞具有4种细胞连接,包括紧密连接、缝隙连接、桥粒及黏附连接。成牙本质细胞胞间连接除具有屏障功能以外,还被认为与成牙本质细胞的分化、矿化相关。在上皮细胞中,分离缺陷基因3（Partitioning defective-3,Par3）对上皮细胞胞间连接的结构和功能的调控作用是近年来的研究热点,而成牙本质细胞具有和上皮细胞类似的胞间连接结构。然而成牙本质细胞内是否表达Par3分子,该分子对成牙本质细胞胞间连接的作用如何尚不清楚。此外,在细菌的入侵下牙髓组织将启动一系列复杂的损伤修复反应,包括细胞的增殖、粘附、迁移及细胞外基质的分泌、矿化等生物学活动,成牙本质细胞形成反应性牙本质是该损伤修复反应中极为重要的一环。在肿瘤细胞中报道Par3可通过影响细胞连接介导细胞的表观遗传学变化,然而在成牙本质细胞中Par3是否也存在类似的生物学作用及潜在的分子机制如何也需进一步阐明。目的:1.检测Par3于生理状态及炎症状态下在成牙本质细胞中的表达情况2.探究Par3对小鼠成牙本质细胞系细胞（Odontoblast lineage cells,OLCs）胞间连接的调控作用3.探究极性相关分子Par3在OLCs生物学行为中的作用4.基于全转录组测序技术分析Par3对OLCs的生物学作用及潜在的分子机制研究方法:第一部分:通过免疫荧光实验分别观察Par3在大鼠牙髓组织及OLCs中的表达及分布;利用Western Blot检测炎症状态下OLCs中Par3的表达情况;利用siRNA敲低OLCs中Par3的表达后,通过透射电镜观察Par3表达下调前后OLCs胞间连接结构的变化;利用Western Blot及细胞免疫荧光技术检测Par3表达下调前后细胞连接相关分子带状闭合蛋白-1（Zonula occludens-1,ZO-1）的表达及分布情况。第二部分:通过 EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）、Transwell 及流式细胞术等检测 Par3 表达下调对成牙本质细胞增殖、迁移、周期及凋亡等生物学功能的影响;此外,对Par3表达下调组及对照组OLCs矿化诱导28天,利用Western Blot、茜素红及碱性磷酸酶染色观察Par3对OLCs矿化能力的影响。第三部分:通过全转录组测序技术筛选Par3表达下调后的差异表达基因,结合Dr.Tom系统进行生物信息学分析矿化相关差异基因及信号通路,利用Western Blot检测AKT磷酸化水平及利用RT-qPCR检测编码14-3-3蛋白的mRNA表达水平。研究结果:1.Par3在大鼠牙髓组织中与成牙本质细胞的分布位置存在重叠。体外条件下Par3广泛分布于成牙本质细胞内,并在细胞膜周围呈现高表达,并且炎症诱导可降低成牙本质细胞Par3的表达水平。2.Par3表达下调后小鼠成牙本质细胞胞间连接结构松散,细胞连接相关蛋白ZO-1的表达下调且其分布由细胞膜转移至细胞质;3.Par3表达下调组与对照组相比,细胞增殖、迁移能力增强,凋亡及矿化能力受抑制;4.测序结果一共筛选出2996个差异基因（| log2（FC）|＞0,Q＜0.05）,差异基因主要参与的生物过程和分子功能在于应对刺激和结合等。京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG）通路分析结果显示,差异基因主要富集在调控细胞周期、缝隙连接及PI3K-AKT等负责调控细胞增殖、迁移及炎症反应的信号通路。5.Par3表达下调可通过促进AKT的磷酸化过度激活PI3K-AKT通路;结论:1.Par3表达下调可通过影响ZO-1的表达及分布破坏OLCs胞间连接。2.Par3表达下调尽管可促进细胞的增殖及迁移等防御修复能力然而细胞诱导形成矿化组织的能力却被抑制。3.Par3分子可能通过与14-3-3蛋白相互作用活化PI3K-AKT通路而影响成牙本质细胞系细胞的细胞连接及诸多生物学功能。
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