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背景:光气属于窒息性化学战剂,也是重要的化工原料,被广泛用于药品、染料、杀虫剂、海绵和橡胶制品的生产。光气作为肺刺激剂的典型代表,吸入中毒后可引起严重的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),严重者可发生急性呼吸窘迫综合症(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS),是人员中毒死亡的主要原因。我国作为化工大国,光气产量巨大且使用频繁,光气中毒事件时有发生,往往导致大量人员伤亡。由于光气的高毒性和高分散性,国内外对光气的中毒机制和救治措施的研究虽然取得了一定进展,但中毒机制仍然不清,迄今仍缺乏有效治疗措施。因此,光气防治是我国亟待解决的重大公共卫生问题。α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin,α1-AT)是一种广谱蛋白酶抑制剂,作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的主要成员,主要由肝脏合成。作为一种急性时相反应蛋白,α1-AT在急性炎症发生时可通过毛细血管进入组织液,在组织损伤部位富集后发挥免疫调节功能。传统观点认为,α1-AT主要功能是直接抑制血清中中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、蛋白酶3和组织蛋白酶G的活性。临床上,α1-AT缺乏症是一种先天性代谢病,血清因α1-AT水平降低,失去对胰蛋白酶活性的抑制作用,从而导致婴幼儿肝炎和成人肺气肿的发生,注射重组α1-AT是α1-AT缺乏症患者常用的治疗手段。最近研究表明,α1-AT还具有免疫调节活性,参与机体炎症和凋亡的调控。在缺血再灌注引起的肺损伤中,α1-AT可通过抑制中性粒细胞浸润,减轻肺组织的炎症反应和病理损伤。然而,α1-AT能否用于治疗光气致ALI目前尚不明确。因此,本课题以光气中毒这一重要公共卫生问题入手,深入研究光气致ALI的发病机制,系统探究α1-AT在光气致ALI中的作用,为其早期诊断和有效治疗提供新思路。目的:1.明确光气暴露大鼠肺组织α1-AT的变化规律和主要来源。2.探讨α1-AT在光气致大鼠ALI和光气诱导支气管上皮细胞损伤中的保护作用。3.探讨光气致ALI中α1-AT发挥抗炎保护作用的主要机制。方法:1.建立光气鼻吸入暴露致大鼠ALI模型。50只SD大鼠随机分为5组,每组10只。对照组吸入空气,其余组大鼠给予41 mg/m3光气鼻吸入30 min,分别在暴露后后3、6、12和24 h使用全身体积描记检测系统检测Penh,并处死大鼠,收集动物肺脏灌洗液、肺脏和血液,探讨光气所致大鼠肺功能和ALI指标的变化规律。HE染色观察肺组织病理变化,称量肺湿重,BCA法测BALF总蛋白含量,瑞士-吉姆萨染色和免疫荧光检测肺组织炎症细胞含量,ELISA检测炎症分子的含量、Western blot检测炎症转录和凋亡分子蛋白表达,TUNEL试剂盒检测肺组织凋亡。2.α1-AT在光气诱导大鼠ALI中的表达和来源。给予大鼠41 mg/m3光气鼻吸入30 min,于暴露后3、6、12和24 h处死大鼠。Western blot检测肺组织α1-AT蛋白表达,ELISA检测血清和BALF中α1-AT含量,免疫荧光检测肺组织中α1-AT的表达和细胞定位:SP-C标记肺泡II型细胞、CD68标记巨噬细胞、Ly6G标记中性粒细胞,观察α1-AT在上述细胞中的定位。3.建立光气致人源支气管上皮细胞(BEAS-2B)损伤模型。给予0.025 mg/m L重组α1-AT蛋白干预BEAS-2B细胞30 min后,正常组给予空气,光气暴露组给予3.2 mg/m~3光气60 min,暴露12 h后,RT-PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平;暴露48 h后,流式细胞仪检测凋亡指标的变化。4.重组α1-AT蛋白在光气诱导大鼠ALI中的作用。光气暴露大鼠雾化吸入20mg/kg重组α1-AT蛋白,WBP检测Penh,HE染色观察肺组织病理变化,称量肺湿重,BCA法检测BALF总蛋白含量,ELISA检测肺组织和BALF中IL-1β和IL-6含量、Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达,TUNEL试剂盒检测肺组织凋亡,试剂盒检测caspase-3/9的活性。5.α1-AT作用机制的研究。0.025 mg/m L重组α1-AT蛋白处理BEAS-2B细胞12h,RNAseq技术筛选差异表达基因。通过对GO富集的炎症相关调控基因筛选,发现ID1可能是α1-AT的作用靶分子。si RNA技术敲减ID1后,RT-PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA水平,Western blot检测ID1蛋白表达。结果:1.41 mg/m3×30 min光气暴露大鼠后,HE染色观察到,大鼠肺泡结构破坏,且肺组织充血、炎细胞浸润,肺湿重、肺体比和BALF总蛋白随光气暴露时间延长逐渐增加,表明光气暴露导致肺组织发生急性损伤。肺组织中性粒细胞增多、巨噬细胞减少,IL-6和MPO等炎症因子表达增多,提示肺组织发生炎症反应。此外,肺组织支气管TUNEL阳性细胞增多、凋亡蛋白Cleaved caspase-3表达增高、Bax/Bcl-2比值增加,表明光气暴露导致肺组织细胞发生凋亡。2.41 mg/m3×30 min光气暴露大鼠后,大鼠肺组织中α1-AT蛋白表达逐渐升高,ELISA测定发现血清和BALF中α1-AT含量也不断增加。免疫荧光检测表明,光气暴露后肺组织巨噬细胞(CD68标记)数量减少,中性粒细胞(Ly6G标记)数量增多;α1-AT荧光亮度增加,在巨噬细胞和肺泡II型细胞(SP-C标记)中几乎无共定位表达,但在中性粒细胞中共定位表达较多。上述结果提示,光气暴露后肺组织α1-AT出现应激性升高,且主要来源于中性粒细胞。3.3.2 mg/m~3×60 min光气暴露BEAS-2B细胞后,RT-PCR检测发现肺组织中IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA水平增加。Annexin V/PI实验表明,光气暴露后细胞凋亡率显著升高。给予0.025 mg/m L重组α1-AT蛋白处理BEAS-2B细胞30 min后,再暴露于相同剂量的光气,暴露后12 h,IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA水平降低,暴露后48 h,细胞凋亡水平明显减少。4.雾化吸入给予光气暴露大鼠20 mg/kg的α1-AT重组蛋白,可显著降低Penh,降低光气引起的炎细胞浸润、肺组织出血和BALF总蛋白升高,减少光气诱导的肺组织IL-1β和IL-6炎症因子表达,抑制光气暴露后大鼠肺组织中Bax/Bcl-2比值、caspase-3和caspase-9活性的升高。提示,雾化吸入α1-AT重组蛋白可抑制光气暴露大鼠肺组织炎症反应和细胞凋亡,改善光气导致的ALI。5.RNAseq筛选发现,α1-AT处理后共计126个基因发生显著变化,其中GO功能富集中与炎症调控相关的基因共计14个,筛选后发现ID1可能是α1-AT的作用靶分子。Western-blot和RT-PCR验证发现,α1-AT处理可促进ID1 m RNA和蛋白的表达水平。病毒载体敲减ID1后发现,BEAS-2B细胞中IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA水平增高。此外,在光气暴露致大鼠ALI中发现,ID1蛋白水平降低。结论:1.光气暴露后大鼠发生ALI,炎症反应和支气管细胞凋亡是主要机制。2.光气暴露后大鼠肺组织α1-AT应激性升高,在巨噬细胞和肺泡II型细胞几乎不表达,主要来源可能是中性粒细胞。3.雾化吸入重组α1-AT蛋白抑制了光气暴露大鼠肺组织炎症反应和支气管细胞凋亡,显著改善了光气暴露大鼠肺组织功能。4.RNAseq筛选提示,ID1可能是α1-AT发挥抗炎效应的靶分子,α1-AT对光气致ALI的保护作用可能与上调ID1有关。