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孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）,又称孤独症,是一类严重的神经发育障碍性疾病,具有两大核心症状:社交障碍/交流障碍和重复刻板行为及兴趣狭窄。社交障碍致患者融入社会困难,受到广泛关注,研究较多。但是,重复刻板行为关注却相对较少。事实上,重复刻板行为常早于社交障碍起病,加重患者社交障碍。目前关于重复刻板行为机制研究较少,特别是关于刻板行为本身调控的神经环路研究尚缺乏。此外,刻板行为涉及到运动的序列调控,而运动协调障碍也是ASD患者常见的症状之一,对其发生机制仍关注不多。SHANK3蛋白是一种突触后骨架蛋白,在促进兴奋性突触发育、成熟及维持树突棘形态等发挥重要作用。Shank3基因敲除（knockout,KO）小鼠表现出典型的孤独症样社交障碍和重复刻板行为,是研究孤独症较好的模型之一。其重复刻板行为主要是过度理毛行为,这种过度理毛行为甚至造成皮毛损伤。理毛行为是啮齿动物一种内在刻板样行为,占据啮齿动物清醒状态30-40%的时间。我们课题组以往发现Shank3 KO孤独症小鼠背外侧纹状体（dorsal lateral striatum,DLS）异常与过度刻板理毛行为相关。但是DLS相关神经环路在刻板行为中发挥怎样的作用尚不清楚。此外,我们之前发现Shank3 KO小鼠在旷场中运动距离明显降低,提示该小鼠可能具有运动障碍,但具体机制缺乏研究。本研究以理毛行为和运动为切入点,综合运用光遗传、化学遗传、行为学等多种手段,探究DLS相关神经环路在刻板行为中发挥的作用,以及孤独症模型中运动障碍的相关神经机制。具体实验分为以下两个部分:第一部分MD-DLS和BLA-DLS在刻板理毛行为中的双向调控作用目的:探究以DLS为核心的神经环路在刻板理毛行为的调控作用方法:基于人工智能的行为自动分析确定理毛行为在自发行为中比例,c-Fos染色确定理毛行为相关脑区,顺行和逆行病毒示踪确定DLS上游投射脑区,光遗传及化学遗传学结合Cre小鼠和理毛行为分析研究与DLS形成突触上游脑区在理毛行为中的作用。结果:1)兴奋DLS整体对理毛行为无作用,兴奋DLS直接通路促进理毛行为,兴奋DLS间接通路抑制理毛行为。DLS内D1和D2阳性神经元比例相当。提示DLS直接通路和间接通路相互平衡调控理毛行为。2)逆行追踪病毒显示次级运动皮层（secondary motor cortex,M2）、初级感觉皮层（primary somatosensory cortex,S1）、背内侧丘脑（mediodorsal thalamic nucleus,MD）、基底杏仁核（basolateral amygdaloid nucleus,BLA）对DLS有相对较高的投射。3)利用孤独症模型和急性束缚模型诱发大量理毛行为,c-Fos染色发现这四个脑区在理毛行为过程中均被激活。4)光遗传分别兴奋四个脑区后发现蓝光兴奋MD促进理毛行为发生,而兴奋BLA抑制理毛行为发生;兴奋M2和S1对理毛行为无明显作用。5)光遗传兴奋MD-DLS环路促进理毛行为,兴奋BLA-DLS环路抑制理毛行为;化学遗传学抑制MD-DLS环路后理毛行为降低,而抑制BLA-DLS环路后理毛行为增加。提示MD-DLS环路和BLA-DLS环路反向调控着理毛行为。结论:我们发现激活DLS直接通路促进理毛行为,而激活DLS间接通路抑制理毛行为。M2、S1、MD和BLA是DLS主要传入核团,激活MD脑区以及MD-DLS环路可以促进理毛行为发生,而激活BLA脑区和BLA-DLS环路会降低理毛行为发生。我们的研究结果为理解刻板理毛行为及解析ASD过度理毛神经环路机制提供了潜在的依据。下一步我们将对ASD小鼠该环路的病理性改变进行深入研究。第二部分Shank3 KO孤独症模型中小脑异常与运动障碍的关系目的:探究孤独症模型中运动障碍神经病理机制方法:旷场实验、加速转棒实验和步态实验检测评估小鼠的运动能力,大体形态学测量、病毒标记技术、稀疏标记技术和神经元3D重塑技术分析小脑外观、分叶和细胞面积等形态改变,离体脑片膜片钳研究小脑浦肯野细胞电生理特性,小脑局部敲除结合行为学验证浦肯野细胞在Shank3 KO小鼠运动障碍中的特异性。结果:1)Shank3 KO孤独症小鼠除表现典型孤独症样行为外,在旷场中的运动距离明显减少,孤独症小鼠的加速转棒表现正常,而步态异常明显。2)Shank3 KO孤独症小鼠小脑体积和质量没有明显改变。但是,正中矢状面切片定量分析显示分子层、浦肯野细胞层和颗粒层面积明显减少。减少的分子层可能归因于其内高尔基细胞、星形细胞以及篮状细胞树突和胞体的减少,而浦肯野细胞层的减少则主要是由浦肯野细胞面积减少导致的。3)作为小脑内唯一的传出神经元,浦肯野细胞表现出不同分叶的胞体面积异常;离体电生理发现浦肯野细胞的兴奋性降低,放电减少。4)在选择性敲除浦肯野细胞内Shank3后,小鼠表现出步态异常,与全身敲除Shank3类似。但是条件敲除鼠在旷场内运动距离以及孤独症核心症状表现没有发生改变,表明浦肯野细胞异常是孤独症步态异常的重要机制之一。结论:Shank3 KO小鼠表现出运动障碍和步态异常,且与小脑异常高度相关。其中浦肯野细胞形态及功能障碍可能是步态异常的重要原因。当仅将浦肯野细胞内Shank3敲除后,小鼠即表现出步态异常,进一步表明浦肯野细胞异常与步态异常之间存在着因果关系。我们的研究结果有助于理解浦肯野细胞结构功能异常在孤独症中运动障碍的重要作用。