研究背景放射治疗是目前临床治疗肿瘤的主要方法之一。放射治疗诱导的远端效应是指患者照射部位接受电离辐射后,其远端的非照射区域发生的辐射效应。放射治疗诱导的远端效应具有两面性,既可以使远端转移瘤消退,也可损伤未照射的远端正常组织,从而给肿瘤患者带来一系列不良反应,严重影响肿瘤患者的生活质量。目前,临床常用的放射治疗分为常规分割（单次照射剂量为2 Gy）和大分割（单次剂量＞2.5Gy）两种模式;大分割模式由于具有放疗时间短,费用低,疗效好等优点,近年来在临床肿瘤治疗中开始被应用并推广。近年来,育龄男性胸部肿瘤患者放疗后出现的生育力降低问题已经引起人们关注。众所周知,睾丸是对电离辐射较为敏感的器官之一,但睾丸对胸部电离辐射诱导的远端效应敏感性尚不清楚。研究发现,胸部电离辐射诱导的远端效应可致小鼠睾丸结构和功能损伤,使精子发生受损并导致生育能力降低。据报道,炎症因子和自由基等可能是电离辐射诱导远端效应的重要信号分子,但其远端效应机制尚未完全阐明。因此,本研究以雄性小鼠为研究对象,采用病理学和分子生物学等实验方法,首先,观察了X射线胸部照射后小鼠外周主要脏器形态结构的变化;然后,研究了X射线胸部照射诱导小鼠精子发生的损伤效应的特点;最后,从炎性因子和氧化应激等方面初步探讨了X射线胸部照射诱导小鼠精子发生损伤的作用机制。整个研究分为以下三个部分:第一部分X射线胸部照射对小鼠主要脏器的影响材料与方法1.动物分组:6～8周龄健康成年雄性C57BL/6小鼠,体重（21.5±1.1）g。随机分为假照射组（Sham组）、屏蔽组（Shielded组）和照射组（Radiation组）,每组6只,在照射后第5 W取材。2.X射线照射:采用X射线照射小鼠胸部,照射参数为:工作电压160 kV,工作电流25 mA,剂量率2.308 Gy/min。Radiation组小鼠每天胸部接受X射线照射1次,每次5 Gy,连续照射4 d,总吸收剂量为20 Gy;Sham组小鼠照射方式同照射组,但X射线辐照仪电源未开启;Shielded组小鼠在完全屏蔽装置接受照射。3.实验方法:1)采用蒙特卡罗方法模拟计算小鼠屏蔽装置下各主要脏器的吸收剂量;2)采用苏木素-伊红（Hematein-Eosin,HE）染色,光学显微镜下观察小鼠肺脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏和睾丸的结构。研究结果1.小鼠主要脏器X射线吸收剂量的模拟计算结果辐射计量仪检测到的屏蔽装置内睾丸区域散射剂量率为0.03 Gy/min,为总照射剂量的1%。采用蒙特卡罗方法模拟计算小鼠屏蔽装置下各主要脏器的吸收剂量,结果显示,X射线胸部照射时小鼠睾丸吸收剂量为0.087 Gy。上述结果表明,本实验采用的屏蔽装置可有效屏蔽胸部X射线的散射。2.X射线胸部照射对小鼠主要脏器的影响HE染色结果显示:X射线胸部照射后,Shielded组的小鼠主要脏器（肺、心脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏）的结构无明显改变;Radiation组中,除了胸部照射区域内的肺组织发生结构破坏之外,远端未照射区域的睾丸组织形态也出现明显病理损伤,其他脏器组织结构仅出现轻微或无明显损伤。提示睾丸对胸部电离辐射诱导的远端效应较为敏感。研究结论本部分研究结果表明,X射线屏蔽装置的屏蔽效果较好;睾丸是胸部电离辐射远端效应的敏感器官。第二部分X射线胸部照射对小鼠精子发生的损伤效应材料与方法1.动物分组:6～8周龄健康成年雄性C57BL/6小鼠,体重（20.2±1.4）g。随机分为Sham组和Radiation组,每组10只。在照射后第1 W、3 W和5 W取材。2.X射线照射方法同第一部分实验。3.实验方法:1)照射期间每天监测小鼠体重,照射结束后每3 d监测小鼠体重;2)采用苏木素-伊红（HE）染色,光学显微镜下观察小鼠睾丸和附睾尾结构;3)采用Image J 1.43 u软件十字交叉法测量小鼠睾丸生精小管直径和生精上皮厚度;4)透射电镜观察小鼠睾丸超微结构;5)游离双侧附睾尾,在光学显微镜下进行精子计数和精子畸形率分析;6)采用流式细胞仪检测精子存活率和凋亡率;7)采用转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）染色及蛋白杂交（Western Blot）检测小鼠睾丸组织中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平。研究结果1.X射线胸部照射对小鼠一般健康状况的影响小鼠体重及睾丸重结果显示,与Sham组相比,Radiation组小鼠体重在胸部照射后1 W显著降低,睾丸系数升高;照射后3 W和5 W,Radiation组小鼠体重、睾丸重和睾丸系数较Sham组相比显著降低。2.X射线胸部照射对小鼠睾丸结构的影响2.1 HE染色结果显示:与Sham组相比,Radiation组小鼠在X射线照射后1 W,睾丸组织出现生精细胞排列紊乱,管腔内成熟精子减少;随照射后时间的延长损伤逐渐加重,至照射后5 W,小鼠睾丸生精小管内各级生精细胞大量缺失,生精小管腔内成熟精子数目严重减少。2.2生精小管十字法测量结果显示:与Sham组相比,Radiation组小鼠在X射线照射后1 W,生精上皮厚度开始下降,照射后3 W和5 W,生精上皮厚度和生精小管直径均显著下降。3.X射线胸部照射对小鼠睾丸超微结构的影响透射电镜结果显示:与Sham组相比,Radiation组小鼠睾丸组织内生精小管的超微结构严重受损,各级生精细胞间出现缝隙,线粒体明显肿胀,染色质溶解且细胞膜不连续;初级精母细胞出现坏死,血睾屏障结构完整性破坏;间质细胞出现大量肿胀线粒体和脂滴;精子细胞胞浆破裂,胞浆内容物流失。4.X射线胸部照射对小鼠附睾结构的影响HE染色结果显示:与Sham组相比,X射线胸部照射后1 W,小鼠附睾组织结构改变,上皮细胞排列紊乱,细胞核固缩,附睾管腔内精子和分泌物减少;照射后3W和5 W,附睾结构损伤更加严重。5.X射线胸部照射对小鼠成熟精子数量和精子畸形率的影响精子质量结果显示,与Sham组相比,X射线胸部照射后1 W,小鼠精子数量和精子畸形率无明显改变,照射后3 W和5 W,小鼠精子数量显著下降,畸形率显著升高。6.X射线胸部照射对小鼠成熟精子存活率及凋亡的影响小鼠精子细胞流式检测结果显示,与Sham组相比,X射线胸部照射后5 W,小鼠成熟精子存活率显著下降,晚期凋亡率和总凋亡率均显著升高。7.X射线胸部照射对小鼠睾丸细胞凋亡的影响Western Blot结果显示,与Sham组相比,在X射线胸部照射后3 W和5 W,小鼠睾丸组织凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3水平上调,Bcl-2/Bax比值下降。TUNEL染色结果显示,X射线胸部照射后3 W和5 W,睾丸组织TUNEL阳性细胞数目明显增加且定位于生精小管周边。研究结论本实验条件下X射线胸部照射可损伤小鼠的睾丸及附睾结构,精子数量和存活率下降,畸形率和凋亡率升高并诱导睾丸生精细胞凋亡,导致精子发生受损。第三部分X射线胸部照射对小鼠精子发生损伤效应的机制初探材料与方法1.动物分组、X射线照射:同第二部分。2.实验方法:1)采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠肺组织、血清和睾丸组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）以及白介素10（IL-10）含量,以评估小鼠肺组织、血清和睾丸组织中炎性因子水平;2)采用比色法检测小鼠肺组织、血清和睾丸组织中超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）含量以评估小鼠肺组织、血清和睾丸组织的氧化应激水平;3)采用伊文斯兰（EB）荧光显色法检测小鼠血睾屏障的通透性,以评估小鼠血睾屏障的完整性;4)采用ELISA和Western Blot检测小鼠睾丸组织中干细胞因子（SCF）和胶质源性神经营养因子（GDNF）的表达水平,以评估小鼠支持细胞分泌功能;5)采用Western Blot和免疫荧光染色检测小鼠睾丸组织中PLZF和c-kit的蛋白表达水平,以评估小鼠精原干细胞增殖和分化功能;6)采用Western Blot检测小鼠睾丸组织中（PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT）蛋白的表达水平,以评估小鼠睾丸组织中PI3K/AKT通路相关蛋白的变化。研究结果1.X射线胸部照射对小鼠肺组织、血清和睾丸组织炎性因子水平的影响ELISA结果显示:与Sham组相比,照射后3 W和5 W,肺组织中的TNF-α和TGF-β1含量显著升高,IL-10含量显著下降;血清中的TNF-α含量在照射后5 W显著升高,TGF-β1含量在照射后3 W和5 W显著升高,IL-10含量在照射后5 W显著下降;睾丸组织中TNF-α和IL-10含量在照射后3 W和5 W显著升高,TGF-β1含量在照射后3 W显著升高。2.X射线胸部照射对小鼠肺组织、血清和睾丸组织氧化应激水平的影响比色法结果显示:与Sham组相比,小鼠肺组织中T-SOD水平在照射后5 W显著下降,MDA水平在照射后3 W和5 W显著升高;血清中T-SOD水平在照射后3 W和5 W显著下降,MDA水平在照射后3 W和5 W显著升高;睾丸组织中T-SOD水平在照射后5 W显著下降,MDA水平在照射后3 W和5 W显著升高。3.X射线胸部照射对小鼠血睾屏障通透性的影响EB荧光显色结果显示:Sham组小鼠睾丸组织中生精小管官腔内照射后3 W和5 W未见EB渗出,Radiation组小鼠睾丸组织中生精小管内可见大量EB呈弥散状渗出。4.X射线胸部照射对小鼠睾丸支持细胞分泌功能的影响ELISA与Western Blot结果显示,与Sham组相比,Radiation组小鼠睾丸组织中GDNF和SCF蛋白水平在照射后3 W和5 W显著增加。5.X射线胸部照射对小鼠精原干细胞的影响Western Blot与免疫组化结果结果显示,与Sham组相比,Radiation组小鼠睾丸组织中PLZF蛋白水平在照射后3 W和5 W显著降低;c-kit蛋白水平在照射后3 W和5 W显著升高。6.X射线胸部照射对小鼠睾丸PI3K/AKT通路的影响Western Blot结果显示,与Sham组相比,Radiation组小鼠睾丸组织中P-PI3K和P-AKT蛋白水平在照射后3 W和5 W显著升高。研究结论本实验条件下,X射线胸部照射后肺-血液-睾丸级联炎症反应及氧化应激,导致血睾屏障通透性增加,支持细胞分泌功能紊乱,精原干细胞增殖下降而分化能力升高,最终损伤小鼠精子发生,其机制可能与SCF/c-kit受体信号激活PI3K/AKT通路有关。