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细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）是具有双层膜结构的囊性囊泡,几乎由所有细胞分泌。主要包括直径为50-150 nm的、晚期核内体衍生的外泌体（Exosomes）,和直径为100-2000 nm、质膜出芽生成的微囊泡（Micro Vesicles,MVs）。肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是小RNA病毒科肠道病毒属成员,主要引起手足口病,其分泌的外泌体携带病毒RNA,在其感染致病过程中发挥着重要的作用,但EV71病毒RNA是如何特异性的被分选进入外泌体尚无研究。考虑到病毒的非结构蛋白2C具有RNA结合性,可能参与病毒RNA的分选,本课题拟探究EV71的2C蛋白是否调控分选病毒核酸进入外泌体及其可能机制。目的:分析EV71感染细胞分泌的外泌体内包含的病毒组分及其感染性,探究EV71非结构蛋白2C分选病毒核酸进入外泌体的作用及其机制。方法:1.利用Opti Prep TM连续密度梯度离心法分离EV71感染后Vero细胞的上清,分别收集不同密度区带中的组分,免疫印迹法（Western Blot,WB）检测各组样本中的外泌体特征性蛋白和EV71衣壳蛋白,纳米颗粒跟踪分析（Nanopaticle Tracking Analysis,NTA）检测各组样本的颗粒粒径,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测各组样本中的病毒RNA拷贝数。q RT-PCR检测病毒感染后分泌的外泌体（Exo-EV71）内病毒正负链表达水平,荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）检测胞内EV71 RNA的定位。将Exo-EV71与未感染细胞共培养,普通显微镜下观察细胞病变效应（cell cytopathic effect,CPE）。2.用lipo3000在Vero细胞中分别转入p FLAG-2C质粒（后续称2C-Vero）和p FLAG对照质粒（后续称NC-Vero）,用等量MOI的EV71病毒分别感染两组细胞,分别利用聚乙二醇（PEG）沉淀法和差速离心法提取上述两种细胞来源的外泌体和MVs,q RT-PCR分别检测细胞、外泌体和MVs内的病毒RNA拷贝数,计算外泌体中的病毒RNA拷贝数占总病毒RNA（细胞、MVs和外泌体三者病毒RNA拷贝数总和）的比例,比较EV71感染2C-Vero和NC-Vero两组细胞后,病毒RNA进入外泌体比例的不同。利用病毒RNA探针,GFP荧光定位内体蛋白Rab5,FISH实验分别检测EV71感染的2C-Vero细胞和NC-Vero细胞内的EV71病毒RNA,采用曼德尔共定位系数比较两组细胞内体中的EV71病毒RNA含量占总病毒RNA含量的比例,分析2C蛋白对病毒RNA进入细胞内体的影响。3.利用质谱技术筛选与2C蛋白相互作用的可能靶蛋白,免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测2C蛋白与HSPA8蛋白的直接结合,激光共聚焦显微镜观察2C蛋白与HSPA8蛋白在胞内的共定位。4.利用HSC70/Hsp70抑制剂Ver155008抑制胞内HSPA8（HSC70）蛋白表达后,将p FLAG-2C质粒和p FLAG对照质粒分别转染HSPA8表达缺陷细胞,用等量MOI的EV71病毒感染,提取上述两种细胞来源的外泌体和MVs,比较两组外泌体中的病毒RNA占总病毒RNA含量的比例,分析HSPA8蛋白在2C分选病毒RNA进入外泌体过程中的作用。用CRISPR技术构建HSPA8敲除细胞株,进一步验证HSPA8蛋白在2C分选病毒RNA过程中的作用。5.等量MOI的EV71病毒感染2C-Vero和NC-Vero细胞,利用RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）技术检测细胞内HSPA8蛋白与EV71病毒RNA的结合情况;PEG沉淀法提取EV71病毒感染2C-Vero来源的外泌体,RIP实验检测外泌体内HSPA8蛋白与EV71病毒RNA的结合情况,探究HSPA8蛋白辅助2C分选病毒RNA的作用机制。6.利用蛋白结构对接工具ZDOCK软件对HSPA8蛋白和2C蛋白的结合位点进行生信分析,根据分析结果构建一系列2C蛋白截断性片段的表达质粒,将不同片段的质粒转染Vero细胞,CO-IP技术筛选两者可能的结合位点。结果:1.EV71感染细胞上清中的6、7、8分层同时含有病毒RNA和外泌体标志物CD63,未检出病毒结构蛋白VP1,NTA结果显示粒径范围为130nm左右;q RT-PCR结果显示,Exo-EV71中存在大量的正链RNA;FISH结果显示,部分正链RNA定位于细胞内体中;Exo-EV71与Vero细胞共培养72h后普通显微镜观察到细胞出现CPE。2.与对照细胞相比,2C-Vero细胞来源的外泌体中病毒RNA占总病毒RNA的比例明显增高,差异具有统计学意义（**,p＜0.01）。与对照细胞相比,2C-Vero细胞内体中的病毒RNA比例升高,差异具有统计学意义（*,p＜0.05）。3.HSPA8蛋白能够与2C蛋白直接结合,且在胞质与2C蛋白共定位。4.抑制或敲除胞内HSPA8蛋白后,EV71感染2C-Vero细胞来源的外泌体中的病毒RNA比例与NC-Vero组相比,差异无统计学意义（ns,p＞0.05）。5.RIP结果显示,HSPA8蛋白与病毒RNA在细胞内存在结合,并且2C-Vero中的HSPA8蛋白比对照组能结合更多的病毒RNA,差异具有统计学意义,(*,p＜0.05;HSPA8蛋白与病毒RNA在外泌体内也存在相互结合。6.当2C蛋白C端片段（氨基酸305-312）被截断之后,免疫共沉淀无法检测到2C蛋白和HSPA8的结合。结论:1.EV71感染Vero细胞分泌的外泌体中含有病毒正链RNA,且具有感染性。2.EV71非结构蛋白2C能够促进病毒RNA分选进入内体,并在外泌体中被释放。3.HSPA8是2C蛋白分选病毒RNA进入外泌体的辅助蛋白。4.2C蛋白结合HSPA8蛋白的可能位点在2C蛋白C端片段（氨基酸305-312）。