基于转录组测序挖掘当归早期抽薹关键基因及功能分析

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:didierda
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当归(Angelica sinensis(Olive.)Diels)的早期抽薹,指栽培当归植株二年生提前进入生殖生长阶段,致使其有效成分无法在营养生长阶段累积,药用部位肉质根萎缩纤维化,彻底失去药用价值的现象。早期抽薹严重影响当归的药性及产量,近年来更是成为限制当归生产可持续化发展的关键因素。鉴于传统农艺措施无法从根本上解决当归早期抽薹的问题,人们试图从分子水平探寻早薹的调控机制,但当归存在遗传背景复杂,基因组信息缺失等诸多问题,因此针对当归早薹分子调控的研究仍处在探索阶段。为全面揭示当归在早期抽薹过程中基因表达的变化,找出调控早期抽薹的关键基因及信号通路,本研究利用高通量三代全长转录组结合二代普通转录组测序技术,比较分析岷县当归早期抽薹的转录组动态特征,挖掘参与调控当归早期抽薹的主效基因,并结合成药期生理生化分析,初步构建当归早期抽薹分子调控网络,进一步完善当归早薹理论,有效的保护了甘肃省道地药材当归生产的可持续发展,并为后续耐抽薹当归新品种的选育提供理论支持。主要研究结果如下:1.在相同自然环境条件下,对岷县、漳县两个传统农家种源当归于成药年返青初期(6月27日),抽薹期(7月14日)和抽薹后期(8月3日)跟踪观测种苗生长发育动态。结果表明:岷县、漳县两种源当归在第二年成药期个体生长发育各项指标随物候变化趋势基本一致;岷县种源植株死亡率低,但抽薹率较高;漳县种源植株抽薹率低,但死亡率较高;整个成药期内早薹植株生长发育指标较正常成药植株均有所增高;早薹植株在返青初期表现为植株体型较大,叶片及茎杆颜色较深的表型。2.成药期跟踪检测岷县、漳县两种源当归花青素含量和四种抗氧化酶活性后发现,在返青初期,早薹植株的花青素含量和过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性分别比正常成药株预先增强,花青素含量分别预增强21.91%(岷县)和22.24%(漳县),CAT活性分别预增强48.33%(岷县)和60.50%(漳县),而后在抽薹期下降至一定水平,抽薹后期再次升高;而正常成药株的花青素含量和CAT酶活性则呈现完全相反的变化趋势,在抽薹期达到峰值;早薹植株和正常成药植株中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和抗坏血酸还原酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性变化趋势相同,但早薹株活性整体高于正常成药株,说明植株抗氧化酶活性越强,存活率越高,但早薹率也越高;相关性分析结果显示花青素与CAT酶之间的相关性随个体物候变化呈逐渐增加的趋势,表明返青期当归嫩叶花青素含量和过氧化氢酶活性预增强引发可以诱发早期抽薹,该过程同时受到SOD、POD和APX酶的协同调节。3.利用超高效液相色谱技术对抽薹初期当归体内24种内源性植物激素含量测定,并分析早薹植株内源激素含量变化,结果显示早薹植株内源性激素脱落酸和反式玉米素含量显著高于正常成药株,而二氢茉莉酸和激动素的含量显著低于正常成药株。4.通过利用第三代高通量全长转录组和二代普通转录组测序相结合的方法,对早薹当归和正常成药当归在预抽薹阶段进行转录组分析,最终三代全长转录组测序产生了43,438个当归全长转录本,平均长度为1996 bp;二代测序共得到了26.1亿次干净的读取。通过基因功能注释和差异主要表达分析,共鉴定得到475个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs);代谢通路富集分析表明,DEGs主要参与半萜类和三萜类生物合成、次生代谢产物生物合成、角质/木栓质和蜡生物合成、不饱和脂肪酸生物合成等过程。共表达网络分析将二代测序得到的18,685转录本归类为24个模块,挑选在早薹植株中差异表达显著的8个模块,与475个DEGs取交集后得到124个共表达的DEGs,最终筛选得到51个与早期抽薹相关的DEGs,主要富集在植物激素信号传导途径、年龄调控开花途径调控、花器官早期发育途径和超长链脂肪酸生物合成途径中。5.利用生物信息学方法从当归全长转录组中鉴定得到了25个As SPL基因。系统发育分析表明当归As SPLs可分为4个亚家族,位于同一进化树分支下的As SPL基因基因结构及其保守基序十分相似,As SPL启动子序列包含多个光信号响应或激素反应相关的顺式作用元件。表达模式和q PCR分析显示,部分As SPLs基因可能在当归早期抽薹过程中具有重要作用,12个As SPL基因在早薹植株中均有较高表达,且丰度较为一致,同时证明了As SPLs在功能上的冗余性。构建拟南芥超表达As SPL转基因植株,结果显示35S::As SPL5植株提前抽薹,证明了As SPL5在可能在当归早期抽薹过程中的主导作用。
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