【摘 要】
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金黄色葡萄球菌（S.aureus）是整条食品链上都需要严格控制的一种食源性致病菌,易引起食物中毒。针对S.aureus现有的检测技术各有优势,但大多依赖于贵重设备和专业人员,极大程度限制其应用范围,很难在基层或资源匿乏的地区普及。因此,需要构建新型的快速检测技术,旨在克服现有检测方法的缺陷。内溶素（endolysin）因能直接裂解革兰氏阳性菌,且不易产生抗药性,成为了一种潜在的新型抗菌材料。荧光标
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金黄色葡萄球菌（S.aureus）是整条食品链上都需要严格控制的一种食源性致病菌,易引起食物中毒。针对S.aureus现有的检测技术各有优势,但大多依赖于贵重设备和专业人员,极大程度限制其应用范围,很难在基层或资源匿乏的地区普及。因此,需要构建新型的快速检测技术,旨在克服现有检测方法的缺陷。内溶素（endolysin）因能直接裂解革兰氏阳性菌,且不易产生抗药性,成为了一种潜在的新型抗菌材料。荧光标记的细胞壁结合域（CBD）作为一种检测手段,引起了研究者们的极大兴趣。CRISPR/Cas12a系统作为一种体外诊断领域的前沿技术,具有cr RNA引导的Cas蛋白识别靶标DNA激发非特异性单链DNA切割活性;重组酶聚合酶扩增（RPA）无需精密控温设备,在恒温下可实现靶标的指数扩增;此外,磁珠富集技术具有简单、快速的特点。基于以上检测技术的优势,为开发一种S.aureus新检测方法,提供了重要支撑。本研究以噬菌体80α增殖后期产生的endolysin为对象,对其在不同温度、PH、Na Cl浓度下的裂解活性进行研究;为进一步了解80αendolysin的功能域,本研究克隆了80αendolysin C末端的2个不同截短区,即单独的CBD和酰胺酶Amidase 3-CBD,并与绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达蛋白,结合荧光显微镜、流式细胞仪以及蛋白免疫印迹（WB）分析,对不同环境下蛋白结合S.aureus能力进行定性和定量研究;另外,本研究基于荧光标记CBD的特异性识别能力,结合磁珠的富集特点、RPA技术、以及新兴的CRISPR/Cas12a技术,旨在构建一种新的金黄色葡萄球菌的快速检测技术。本研究通过降低浊度实验表明80αendolysin对S.aureus有较强的裂解能力,最适反应温度为4℃,最适p H为9,浓度为0.4 mg/m L的80αendolysin能在20 min内将细菌悬液的OD600从1.1下降到0.1,当缓冲液中Na Cl浓度为0 m M时,80αendolysin裂解活性最高,其裂解活性与Na Cl浓度呈反比。另外,本研究结果表明酰胺酶Amidase3-CBD比单独的CBD与S.aureus的结合能力更高。同时,重组蛋白的稳定性实验表明EGFP-Amidase 3-CBD最适反应温度为4℃,最适p H为7,最适Na Cl浓度为100 m M时,结合能力最高。随着Na Cl浓度的升高,结合能力下降;基于上述结果,本研究结合磁珠富集、RPA和CRISPR/Cas12a技术,构建了一种S.aureus快速检测技术。该技术被成功应用于牛奶、橙汁等食品中S.aureus的检测。整个检测方法仅在37℃下,2.5h内可以完成,并且检测人工污染牛奶样品的灵敏度为10 CFU/m L。该技术不需要专业技术人员或辅助设备,具有良好的发展前景,对于食源性疾病预防和诊断具有重要意义。
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