【摘 要】
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牛结核病（Bovine Tuberculosis,b TB）是由结核分枝杆菌复合体成员牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种具有高度传染性的慢性人兽共患疾病。其特征是进行性消瘦、低度波动性发热、虚弱和食欲不振。核转录因子-κB（NF-κB）在调控机体免疫应答、炎症反应、细胞存活等方面发挥重要作用。已有研究证明,在结核分枝杆菌致病基因转录因子及其调控网络节点中,NF-κB参与
【基金项目】
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广州市珠江科技新星项目（201610010073）； 广东省自然科学基金项目（2017A030310032）；
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牛结核病（Bovine Tuberculosis,b TB）是由结核分枝杆菌复合体成员牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种具有高度传染性的慢性人兽共患疾病。其特征是进行性消瘦、低度波动性发热、虚弱和食欲不振。核转录因子-κB（NF-κB）在调控机体免疫应答、炎症反应、细胞存活等方面发挥重要作用。已有研究证明,在结核分枝杆菌致病基因转录因子及其调控网络节点中,NF-κB参与其中。Ptp A是分枝杆菌分泌的一种蛋白磷酸酶,对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的致病性非常重要,对宿主巨噬细胞内吞噬体的成熟有抑制作用。Ptp A还可以结合DNA,调节宿主中某些与先天免疫相关基因的表达并促进细胞增殖,进而抑制宿主先天免疫。Ptp A利用宿主泛素系统,依赖Jnk、p38和NF-κB信号通路来抑制先天免疫。虽然牛分枝杆菌与结核分枝杆菌有着超过99.95%的基因相似度,但是牛分枝杆菌Ptp A蛋白是否具有类似结核分枝杆菌Ptp A蛋白的作用目前尚不清楚,探究该作用可为牛结核病的防控提供新的方向。本研究构建重组慢病毒过表达质粒p CDH-Ptp A,与Ps Pa X2质粒和PMD2.G质粒共转染至HEK293T细胞中包装慢病毒,收集慢病毒后感染RAW264.7细胞,利用药物筛选方法获得稳定表达细胞系Ptp A-RAW,用RT-PCR、间接免疫荧光法及Western Blot对其进行鉴定,并用相同的方法获得p CDH-RAW细胞系;利用重叠延伸PCR,对Ptp A进行定点突变后构建p CDH-ΔPtp A重组质粒,并构建ΔPtp A-RAW细胞系;用Cell Counting Kit-8检测RAW264.7、Ptp A-RAW、p CDH-RAW和ΔPtp A-RAW细胞的生长曲线及Ptp A-RAW、p CDH-RAW和ΔPtp A-RAW细胞的活性;利用激光共聚焦显微镜对Ptp A-RAW中的Ptp A蛋白进行定位;用所构建的Ptp A-RAW和p CDH-RAW细胞系进行串联亲和纯化（TAP）结合质谱（MS）试验对Ptp A蛋白在RAW264.7细胞中的互作蛋白进行筛选,并对结果进行生物信息学分析;用所收集的p CDH-Ptp A、p CDH-空载体两种慢病毒分别感染RAW264.7细胞,用q RT-PCR检测不同时间点Ptp A蛋白对RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关细胞因子表达量的影响;分别提取ΔPtp A-RAW和Ptp A-RAW细胞的总RNA,用q RT-PCR检测Ptp A突变与否对RAW264.7细胞NF-κB信号通路调控作用的影响。试验结果发现:成功获得稳定表达细胞系Ptp A-RAW、p CDH-RAW和ΔPtp A-RAW;4种细胞的生长符合正常细胞的生长趋势;Ptp A-RAW细胞活力增强,ΔPtp A-RAW细胞活力下降;Ptp A蛋白存在于RAW264.7细胞质和细胞核中;Ptp A蛋白在RAW264.7细胞中的互作蛋白有71种。KEGG分析中发现这些蛋白参与70条信号通路,其中6条信号通路与NF-κB信号通路相关联,这6条信号通路涉及到的Ptp A相互作用蛋白有:C1qb、C3、Hsp90ab1、Nppa、C1qa、Gapdh。String分析发现Gapdh、Hsp90ab1、Nppa有直接联系,C1qb、C3、C1qa有直接联系,它们之间通过Apoe的连接存在间接联系;Ptp A组凋亡抑制因子（TRAF-1、TRAF-2、c-IAP 1）表达量基本上都极显著高于对照组。另外,Ptp A组与对照组相比:加入TNF-α12 h时,Beclin表达量显著下降,未加入TNF-α24 h时,PIK3CA、Beclin表达量极显著下降,加入TNF-α24 h时,PIK3CA、Beclin表达量显著下降;Ptp A-RAW组与ΔPtp A-RAW组相比:凋亡抑制因子表达量极显著上升,自噬因子表达量显著下降,TNF-α和IκBα表达量极显著下降。所有试验结果表明:牛分枝杆菌Ptp A蛋白存在于RAW264.7的细胞质与细胞核中,可能通过其相互作用蛋白间接抑制NF-κB信号通路的激活来促进凋亡抑制因子的表达和抑制自噬因子的表达而抑制RAW264.7的凋亡和自噬,从而躲避机体的免疫机制实现免疫逃避作用,促进牛分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。当Ptp A突变后,对NF-κB信号通路激活的抑制作用减弱或消失。
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