论文部分内容阅读
阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease,AD）是以进行性认知障碍为主要特征的神经退行性疾病。随着我国人口老龄化的发展,有超1000万人罹患AD,给家庭和社会带来了沉重的负担。β-淀粉样肽（β-amyloid Peptide,Aβ）是AD早期诊断和干预治疗的主要靶点之一。本文利用多功能纳米材料的独特优势,构建以Aβ为靶点的新型纳米诊疗体系,应用于AD的早期诊断、治疗与药物筛选领域,为AD的早期诊断与干预治疗提供新的思路和研究方法。第一部分基于多孔ZnO-Co3O4纳米笼的比色法检测β-淀粉样肽目的:开发新型纳米探针ZnO-Co3O4纳米笼（ZnO-Co3O4NCs）用于AD的早期诊断与药物筛选。方法:通过煅烧Zn Co-ZIF合成ZnO-Co3O4NCs,并利用扫描电子显微镜（Scan Electric Microscope,SEM）、透射电子显微镜（Transmission Electric Microscope,TEM）、傅里叶变换红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR）、粉末衍射X射线衍射（Powder X-ray Diffraction,PXRD）等手段进行表征。通过在H2O2存在下,ZnO-Co3O4NCs催化TMB的氧化反应研究其类过氧化物酶活性。基于ZnO-Co3O4NCs的类过氧化物酶活性构建用于检测Aβ单体的比色传感器,并对Aβ单体的检测特异性和实际生物样品中Aβ单体的测定进行了研究。基于不同Aβ物种（包括Aβ单体、Aβ寡聚体和Aβ聚集体）对ZnO-Co3O4NCs类过氧化物酶活性不同的抑制作用,研究了该探针能否用于监测Aβ聚集过程,并与常用的硫磺素T（Thioflavin T,Th T）荧光法进行比较。最后我们以Aβ聚集抑制剂姜黄素和β-环糊精为例,考察了加入姜黄素或β-环糊精的Aβ样品存在下ZnO-Co3O4NCs的催化活性,探讨该体系能否用于筛选Aβ聚集抑制剂。结果:TEM、SEM等结果证明ZnO-Co3O4NCs成功制备,其具有高类过氧化物酶活性。基于ZnO-Co3O4NCs构建的比色法实现了对Aβ单体的特异性检测,检测线性范围为5～150 n M（R~2=0.997）,检测限为3.5 n M,且该方法具有良好的特异性,成功用于大鼠脑脊液中Aβ单体的测定。此外,利用该体系实现对Aβ聚集动态过程的实时监测并筛选Aβ聚集抑制剂。与常用的Th T荧光法相比,该方法对更具神经毒性的Aβ寡聚体表现出更高的敏感性。结论:基于ZnO-Co3O4NCs的纳米探针实现了对Aβ的灵敏检测,并成功用于监测Aβ聚集过程和筛选Aβ聚集抑制剂,这项研究将有助于设计新的诊断试剂,用于监测与蛋白质错误折叠有关的疾病进展和药物筛选。第二部分类氨基酸硒掺杂碳量子点用于AD多靶点协同治疗目的:开发具有抑制Aβ聚集和广谱抗氧化能力的类氨基酸硒掺杂碳量子点（Selenium-Doped Carbon Quantum Dots,Se CQDs）用于多靶点协同干预治疗AD。方法:以内源性硒代胱氨酸（Selenocystine,Se Cys）为前体分子,通过水热法合成Se CQDs,并对其结构及性质进行表征。以·OH为模型,利用ESR光谱等方法研究Se CQDs对活性氧物种（Reactive Oxygen Species,ROS）的清除效率。同时,借助Th T荧光分析、圆二色谱（Circular Dichroism,CD）、TEM形貌表征等手段测定了Se CQDs对Aβ聚集的抑制作用,并采用NMR探究Se CQDs与Aβ之间的结合方式和结合位点。然后分别使用DCFH-DA荧光探针和MTT法研究Se CQDs是否可以降低Aβ聚集体引起的细胞内ROS的产生和细胞毒性,并选择JC-1作为荧光探针利用线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）来评估线粒体的功能。为了分析Se CQDs用于体内AD治疗的可能性,以海马区注射Aβ40建立AD大鼠模型,通过Morris水迷宫（Morris Water Maze,MWM）试验来评估Se CQDs改善Aβ诱导的记忆缺陷的能力。然后采用Aβ的免疫组织化学分析（Immunohistochemistry,IHC）表征Aβ在脑内的沉积,并利用Nissl染色来表征AD模型大鼠中神经元损害情况。结果:TEM等表征结果证明Se CQDs的成功制备。Se CQDs能够与发生Aβ强相互作用,抑制Aβ聚集,降低Aβ聚集体引起的细胞毒性。同时,Se CQDs还可以有效清除ROS,具有良好的抗氧化活性。与其前体分子Se Cys相比,Se CQDs表现出高生物相容性。体内实验结果表明,该纳米材料能有效改善由Aβ诱导的AD模型大鼠的记忆缺陷,减少Aβ的积累,抑制神经元变性。结论:多功能纳米抑制剂Se CQDs在保护神经系统免受氧化损伤和抑制β-淀粉样斑块形成方面具有优异的协同作用。能够明显改善AD模型大鼠记忆障碍,抑制Aβ的积累和神经元变性,具有巨大的临床应用潜力。这项工作为设计用于AD治疗的多功能纳米抑制剂开辟了一条新的途径。