酵米面制品中Burkholderia gladioli的检测、产毒、比较基因组及风险分析

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唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli,B.gladioli)是污染酵米面制品的主要食源性致病菌之一,部分菌株能产生可致人中毒且具有极高致死率的毒素米酵菌酸,为酵米面制品的食品安全及监管造成严重风险及危害。然而目前相关研究还集中在临床病例报告和毒素合成等方面,仍然缺乏相关的系统研究。因此,对B.gladioli菌株的检测、产毒、基因序列与进化及风险分析的深入了解迫在眉睫。为此,本研究对酵米面制品中B.gladioli的污染状况、产毒情况、菌株遗传进化及其在生产加工中的影响因素进行探究。本研究利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对全国范围内酵米面制品及其加工环境样品进行检测,并结合聚类分析,评估从中分离出的22株B.gladioli的分型情况。利用高效液相色谱揭示22株B.gladioli的产毒能力及其影响因素。进一步运用比较基因组技术探究B.gladioli的物种进化、产毒功能及毒素合成和代谢。同时进行风险分析,研究B.gladioli在实验室模拟酸汤子加工过程中的变化及影响因素。结果如下:检测239份来自全国16个省市的酵米面制品及加工环境中样品,从中分离出22株B.gladioli。样品阳性检出率为3.35%(8/239),且阳性样品中有6份玉米碴子和2份酸汤子。由此可见,酵米面制品存在B.gladioli污染的几率,尤其玉米及酸汤子食品污染情况较为严重。22株B.gladioli聚类分析结果表明当差异水平在0.3时,22株B.gladioli被分为3大分支,其中Bg 3-1和Bg 4-2分别单独成支,说明与其它菌株亲缘关系较远。22株B.gladioli中有11株产米酵菌酸,15株产毒黄素,其中Bg 2-6菌株产米酵菌酸能力最强,是标准菌株Bg CICC 10574的2.5倍。再结合单因素试验和响应面试验探究培养温度、培养时间和培养基p H对B.gladioli菌株产米酵菌酸的影响。结果表明三者均会对B.gladioli产毒产生显著影响(P<0.05),且影响大小依次为培养温度>培养基p H>培养时间;培养温度28℃,培养时间5.5 d,培养基p H 5为B.gladioli最佳产毒条件。因此,酵米面制品加工过程中应特别注意温度的控制。以Bg 2-6菌株(产米酵菌酸能力最强),Bg 4-2菌株(不产米酵菌酸)为研究对象,对照标准菌株进行比较基因组研究。结果显示Bg 2-6米酵菌酸生物合成基因簇(bon BDEFGIJKLM)与标准菌株(bon BCDFGIK)存在明显区别,说明B.gladioli有遗传进化等级的差异。同时,系统发育分析结果表明酵米面制品中强产毒分离株Bg 2-6具有进一步遗传和进化。共有/特有基因分析结果显示Bg 2-6存在“增强毒性”特有基因(PHI:3085和PHI:6956),Bg 4-2存在“效应因子”(PHI:5142),揭示了调控B.gladioli能否产生毒素米酵菌酸及其产毒能力强弱的关键基因。此外,与Bg 4-2相比,Bg 2-6含有更多特有基因参与碳水化合物运输和代谢(G)及脂质运输和代谢(I),同时也参与脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢和磷酸戊糖途径。研究验证了米酵菌酸参与脂代谢、糖代谢的观点,并基于特有基因KEGG数据库注释,从代谢通路角度提出米酵菌酸可能参与辛酸、癸酸及月桂酸的生物合成和糖代谢中的淀粉与蔗糖代谢通路。实验室模拟酸汤子生产过程中发现,B.gladioli的菌落数在加工过程中有变化,在“磨水面”工艺中,B.gladioli菌落数高于发酵、清洗、脱水和成型工艺。生产用水的种类、佩戴手套和穿工作服、磨浆机清洁方式、加工环境温度和环境卫生均对B.gladioli菌落数和产品菌落总数产生影响。综上所述,本研究较为全面的分析了当前酵米面制品中B.gladioli的污染现状及产毒情况,并从基因组层面解析B.gladioli的遗传进化特征;从加工全链条角度探讨B.gladioli的变化及影响因素,为酵米面制品中B.gladioli的监测追踪、产毒机制深入研究和有效防控提供参考和新思路,同时也给酵米面制品良好操作规范的构建提供基础。
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