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目的:收集胃癌新发病例临床信息及中医辨证分型,进行肿瘤相关突变基因、靶向及免疫治疗分子标志物的检测,初步绘制我国胃癌患者肿瘤相关基因突变图谱及探索胃癌中医证型的基因突变特征,深入挖掘中医证型的微观物质基础,实验验证健脾复方胃肠安（WCA）通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬发挥抗肿瘤作用的分子机制。方法:收集2018年6月-2019年12月在上海中医药大学附属龙华医院和上海交通大学医学院附属仁济医院临床病理分期为I-IV期且未经任何治疗的胃癌患者的临床信息,经胃镜活检或手术标本取样,采用二代测序技术（含有450个肿瘤相关基因）,并结合生物信息学方法,对突变基因采用基因本体（Gene Ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,基于oncodrive CLUST算法寻找驱动基因,筛选TCGA数据库中259例白种人的基因突变信息（TCGA队列）,比较我国和欧美胃癌患者突变频率的潜在种族差异,探讨我国胃癌患者的基因突变特点;采用免疫组化及原位杂交等技术检测胃癌靶向及免疫治疗分子标志物人类表皮生长因子受体2（HER-2）、程序性死亡配体1（PD-L1）及Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）,分析上述分子标志物与临床病理特征的相关性。对上述患者填写症状调查表,根据2011年国家中医药管理局医政司颁布的《胃癌中医诊疗方案》进行辨证分型,结合患者基因突变分布信息,描述胃癌中医证型的基因突变特征,及其与胃癌分子标志物的相关性。探讨中医健脾法治疗胃癌潜在的靶点及信号通路。采用体内外实验验证健脾复方WCA抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬发生的机制。细胞活力检测法（CCK-8）检测WCA作用人胃癌细胞MKN45的细胞增殖活力;吖啶橙（AO）染色和单丹磺胺戊二胺（MDC）染色观察WCA对胃癌MKN45细胞自噬小体及自噬囊泡的变化;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测自噬相关m RNA和蛋白的表达,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达。为进一步探讨WCA诱导自噬对增殖的影响,用自噬抑制剂3-MA联合WCA干预MKN45细胞,用AO和MDC染色细胞,并采用CCK-8法检测3-MA调节自噬后对WCA抑制MKN45细胞增殖的影响。构建人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型,给予WCA和生理盐水干预,检测两组抑瘤率,透射电镜观察细胞形态变化,免疫组化及Western blot检测各实验组裸鼠皮下移植瘤组织中的PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达。结果:2018年6月-2019年12月在上海中医药大学附属龙华医院和上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的胃癌新发病例130例（SHGC队列）纳入本研究,SHGC队列中,男性95例,女性35例,中位年龄65岁,I期病例10例,II期病例15例,III期病例87例,IV期病例18例。130例胃癌样本中所有的肿瘤组织中均可观察到至少1种基因突变,每个样品的突变中位数为8个（范围从1到80）,C＞T和T＞C为主要的碱基变异类型。NGS测序共鉴定出363个突变基因,1676个体细胞突变。突变频率最高的前10个基因是TP53、LRP1B、ARID1A、FAT3、FAT4、RNF43、KMT2D、GLI3、PIK3CA、ERBB3。基于oncodrive CLUST算法得到RNF43、PIK3CA、ACVR2A、TGFBR2、KRAS、PTEN、TFE3、ERBB2、TGFBR1、HNF1A、RAD50、FGFR2共12个驱动基因,其中PIK3CA、PTEN、KRAS、ERBB2是PI3K通路相关基因,TGFBR2、TGFBR1、FGFR2、ACVR2A、TFE3是TGF-β通路相关基因。GO和KEGG富集分析显示,与SHGC队列突变基因有显著关联的GO术语有5743个,大多数功能类别与激酶活性有关（P＜0.05）;与SHGC队列突变基因共关联的KEGG信号通路有130条,包括PI3K、EGFR、Ras、Erb B、TGF-β、Hippo等多条通路（P＜0.01）。与TCGA队列相比,SHGC队列的驱动基因TGFBR2（P=0.010）、RNF43（P=0.028）、高频基因TP53（P=0.025）突变频率较高。SHGC队列中,驱动基因TGFBR2和RNF43基因突变形式以移码缺失突变为主;高频基因TP53突变形式以错义突变为主。SHGC队列中PI3K通路相关基因突变频率最高,与TCGA队列相比,SHGC队列的Hippo信号通路突变频率较高（P=0.046）。HER-2阳性占11.5%,多见于肠型胃癌;PD-L1阳性（CPS＞1）占50.0%,多见于高龄患者、胃食管结合部、肠型胃癌;EBV阳性占3.8%,多见于胃食管结合部;MSI-H占10.0%,多见于高龄患者;高TMB占33.8%,多见于高龄患者。对SHGC队列130例病例进行中医辨证分型,结果显示:脾气虚证占66.2%（86/130）,肝胃不和证占47.7%（62/130）,痰湿证占35.4%（46/130）,热毒证占23.8%（31/130）,血虚证占20%（26/130）,血瘀证占16.9%（22/130）,脾肾阳虚证占13.1%（17/130）,胃阴虚证占6.9%（9/130）。130例病例中,15例病例辨证为单证证型,66例病例辨证为2个单证的复合证型,44例病例辨证为3个单证的复合证型,5例病例辨证为4个单证的复合证型。对中医证型和临床病理特征进行相关性分析,IV期患者以脾肾阳虚证为主。我们对中医单证和363个突变基因进行分析后发现,脾气虚证多见ARID1A、PIK3CA、APC基因突变;血虚证多见KMT2C、CTNNB1基因突变;胃阴虚证多见MYC、CTCF、NBN、STK11基因突变;脾肾阳虚证多见BLK基因突变;肝胃不和证多见PREX2、DDR1基因突变;热毒证多见TGFBR2、HNF1A、TFE3、ERBB3、KMT2D等基因突变;痰湿证多见CYP2D6、NKX2-1基因突变。对脾气虚证相关基因进行GO和KEGG富集分析显示,与脾气虚证突变基因有显著关联的GO术语有3145个,功能类别多与激酶活性有关（P＜0.05）,共关联的KEGG信号通路有147条,包括PI3K、EGFR、Rap1、m TOR、TGF-β、Hippo等多条通路（P＜0.01）。脾气虚证的特征基因PIK3CA的突变形式均为错义突变,ARID1A突变形式以移码缺失突变为主。MSI-H多见于热毒证,高TMB多见于脾气虚证,暂未发现中医证型与HER-2、PD-L1、EBV的相关性。对中医单证及单证相关差异突变基因运用无监督层次聚类分析显示脾气虚证+热毒证的复合证型是该聚类分析得出的特征证型,该复合证型表现为MSI-H和高TMB的特点,多有Hippo、TGF-β等信号通路的激活。实验验证健脾复方WCA是否通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥抗肿瘤作用,CCK-8实验显示,与空白组比较,WCA可明显抑制MKN45细胞的增殖能力（P＜0.05）;AO和MDC染色显示,与空白组比较,随WCA浓度的增加,自噬小体和自噬囊泡含量逐渐增加（P＜0.05）;RT-PCR和Western blot结果显示,与空白组比较,WCA组细胞中自噬相关蛋白LC3-II,Beclin1,ATG5,ATG7 m RNA和蛋白表达升高（P＜0.05）,p62表达下降（P＜0.05）,Western blot结果显示,与空白组比较,WCA组p-PI3K、p-Akt、p-m TOR表达水平显著降低（P＜0.05）。与WCA组比较,WCA联合3-MA组的细胞生存率、自噬小体和自噬囊泡的数量下降（P＜0.05）,LC3-II蛋白表达也降低（P＜0.05）,表明自噬可以促进WCA抑制人胃癌MKN45细胞增殖。建立人胃癌MKN45细胞裸鼠皮下移植瘤模型,WCA可明显抑制人胃癌MKN45细胞裸小鼠皮下移植瘤生长（P＜0.05）;透射电镜显示WCA组出现大量的双层或单层包含胞浆成分的自噬体;IHC和Western blot实验结果显示WCA可降低裸鼠皮下移植瘤组织中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达（P＜0.05）。结论:1.我国胃癌驱动基因多为PI3K和TGF-β信号通路相关基因;与欧美患者（白种人）相比较,我国胃癌患者的Hippo信号通路、高频基因TP53、驱动基因RNF43、TGFBR2突变频率较高;HER-2阳性多见于肠型胃癌,PD-LI阳性表达,MSI-H,高TMB多见于高龄患者。2.发现胃癌中医单证的基因突变特征,脾气虚证多有PIK3CA、ARID1A基因突变,多见PI3K信号通路激活;MSI-H多见于热毒证,高TMB多见于脾气虚证;辨证为脾气虚证+热毒证这一复合证型的胃癌患者可能是免疫治疗的适用人群。3.健脾复方胃肠安诱导人胃癌MKN45细胞自噬发挥抗肿瘤作用可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路相关,对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制是胃肠安治疗胃癌的作用机制之一。