【摘 要】
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目的:本研究对香菇C91-3菌株Lp1（Latcripin-1）蛋白中PI3KIII样基因结构域进行克隆,构建LP1-PI3KIII真核表达载体,使其在毕赤酵母GS115中进行重组表达,鉴定其表达产物,并对该蛋白进行分离、纯化。将该蛋白作用于人胃癌SGC细胞,通对其进行抗肿瘤生物学活性检测。为Lp1-PI3K样蛋白进一步的生物学功能与作用机制的研究奠定基础。方法:1、根据Lp1（Latcripin
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目的:本研究对香菇C91-3菌株Lp1（Latcripin-1）蛋白中PI3KIII样基因结构域进行克隆,构建LP1-PI3KIII真核表达载体,使其在毕赤酵母GS115中进行重组表达,鉴定其表达产物,并对该蛋白进行分离、纯化。将该蛋白作用于人胃癌SGC细胞,通对其进行抗肿瘤生物学活性检测。为Lp1-PI3K样蛋白进一步的生物学功能与作用机制的研究奠定基础。方法:1、根据Lp1（Latcripin-1）的基因序列,设计上下游引物,以Lp1基因序列为模板,用PCR的方法扩增Lp1-PI3KIII基因结构域序列。获得目的基因。2、将Lp1-PI3KIII基因克隆到真核表达载体pPIC9K（胞外表达）和pPIC3.5K（胞外表达）中,将重组质粒电转化到毕赤酵母GS115中,构建Lp1-PI3KIII真核表达体系。对筛选为阳性克隆子的菌落进行小量表达鉴定,挑选表达最佳的菌落,对不同时间的表达产物进行SDS-PAGE及western-blot鉴定。对表达产物进行Ni柱亲和纯化和精细纯化,浓缩后BCA测其浓度。3、将目的蛋白作用于人胃癌SGC细胞,作用浓度分别为15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml,作用时间分别为为24h、48h。用CCK8法测定目的蛋白的抑瘤率。用透射电镜法检测目的蛋白对人胃癌细胞SGC的形态学影响,用流式细胞仪检测目的蛋白对人胃癌细胞SGC的凋亡作用。结果:1、经PCR扩增,得到750bp左右的基因片段,经测序,和Lp1基因中PI3KIII样结构域相符。2、成功构建Lp1-PI3KIII真核表达载体,电转入毕赤酵母GS115中,获得阳性克隆子。小量表达结果显示Lp1-PI3KIII-pPIC9K胞外表达载体表达量很低或不表达,Lp1-PI3KIII-pPIC3.5K胞内表达载体表达目的蛋白,大小约为29k Da,和预期结果相符。诱导表达过程中,在72h表达效率最高,western-blot结果显示表达蛋白为Lp1-PI3KIII样蛋白。经his标签亲和层析、疏水层析、Q阴离子交换层析得到纯度在90%以上的目的蛋白。3、对LP1-PI3KIII样蛋白抗肿瘤活性检测,结果为:○1蛋白浓度为15μg/ml时,24h、48h抑瘤率分别为3.11%、5.02%;蛋白浓度为30μg/ml时,24h、48h抑瘤率分别为5.01%、12.2%;蛋白浓度为60μg/ml时,24h、48h抑瘤率分别为8.1%、20.8%;蛋白浓度为120μg/ml时,24h、48h抑瘤率分别为11.8%、37.6%。随着药物浓度的增加,对SGC的抑瘤率也随之增加;药物作用时间增加,SGC的抑瘤率也增加。30μg/ml作用48h和60μg/ml、120μg/ml各组与对照组相比均有统计学意义（P＜0.05）。○2流式细胞仪AV/PI双染法检测细胞凋亡结果表明,SGC细胞经不同浓度的目的蛋白作用后,均出现了早期及晚期凋亡细胞,以晚期凋亡为主。随着Lp1-PI3KIII蛋白浓度的增高,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例也随之增加。○3电镜下观察细胞超微结构的特征。目的蛋白作用于细胞,细胞形态显示胞浆空泡增多,出现大范围的自噬小体。结论:1、本实验成功构建了Lp1-PI3KIII样蛋白毕赤酵母真核表达体系。2、本实验成功在毕赤酵母GS115中表达Lp1-PI3KIII样蛋白,成功进行了精细纯化。3、Lp1-PI3KIII样蛋白的生物学功能经初步研究,可抑制胃癌细胞SGC的生长,诱导胃癌细胞SGC凋亡,同时也可诱导SGC细胞自噬。
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