锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)感染引起的鲤鱼及锦鲤的一种传染性和急性病毒血症。该病的爆发给锦鲤养殖业造成了严重的经济损失。在锦鲤疱疹病毒病诊断方法中,ELISA检测方法方便快捷、费用低廉,使用与在基层推广。本研究以纯化的KHV为包被抗原,建立了鱼血清中KHV抗体的ELISA检测方法,为KHV快速诊断试剂的研究奠定了基础。同时利用PCR技术,克隆了KHVORF59基因片段,并在大肠杆菌中进行高效表达,为基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论基础。本研究主要进行了如下试验：1.以KHV-F347病毒株为研究对象,通过培养锦鲤鳍细胞(KF-1)和鲤上皮瘤细胞(EPC)获得大量KHV,用蔗糖密度梯度离心技术得到了纯化的病毒,Western-blot试验分析显示纯化的病毒具有良好的结合特异性抗体的活性。研究发现KHV在KF传代细胞上不容易产生CPE,但是在EPC和KF细胞交叉培养上,有助于CPE形成。2.以纯化的KHV-F347作为抗原包被酶标板,建立血清锦鲤疱疹病毒病病毒抗体的间接ELISA检测方法。方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳血清稀释浓度为1：800。最佳封闭液为10%脱脂乳,兔抗鲤IgM的最佳工作浓度为1：4000,酶标山羊抗兔IgG的最佳工作稀释度为1：2000。所建立的ELISA方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点,将为我国锦鲤疱疹病毒病的监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。以该方法对84份被检血清进行了检测,总阳性率为2.38%。3.用KF-1细胞增殖KHV-F347,用PCR扩增其ORF59基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体并测序。将ORF59基因亚克隆入pET-32a表达载体,转化BL21表达宿主菌,IPTG诱导表达,并用IDA His Bind树脂纯化试剂盒进行纯化,获得分子量约为20KD的融合蛋白。Western blot试验显示表达蛋白ORF59具有良好的抗原性,为基因工程亚单位疫苗的研制提供了理论基础。