目的:研究发现,非整倍体与肿瘤发生、发展和转移密切相关,因此很多人将其认为是基因组不稳定性的标志。CDC20、Mad2、Mad3、Bub3和BubR1组成的有丝分裂检查点复合体（MCC）,以及与之相结合的有丝分裂中后期促进复合体（APC/C）,作为纺锤体组装检查点（SAC）的重要组成部分。SAC对于维持基因组的稳定性以及确保所有姐妹染色体的有丝分裂过程中的正确分离具有十分重要的意义。然而,MCC在有丝分裂过程中,是如何被精确调控以确保有丝分裂正常进行的机制仍不完全清楚。在前期的研究中,我们发现通过碳离子辐射诱导的长链非编码RNA-LNC CRYBG3可以导致细胞内非整倍体的发生;然而截止到目前,国内外有关lncRNAs通过干扰纺锤体装配检查点（SAC）来影响正常有丝分裂,从而诱发非整倍体的研究尚未见报道。本论文拟人工合成LNC CRYBG3腺病毒载体,采用了一系列的体外细胞实验、体内动物实验,加上一部分宝贵的临床实验来探究了 LNC CRYBG3过表达后的生物学效应以及LNC CRYBG3诱导非整倍体发生的分子机制,为未来探究肿瘤的发生发展机制以及诊断和治疗提供可能的新方向。方法:（1）设计并构建LNC CRYBG3腺病毒（带有GFP标签）,将LNC CRYBG3腺病毒转染Beas-2B和A549细胞,转染24 h后荧光显微镜观察;并提取细胞基因组,应用实时荧光定量PCR来检测LNC CRYBG3表达量的变化;建立LNC CRYBG3过表达细胞系,用来进行下一步的实验研究。设计并构建LNC CRYBG3 shRNA慢病毒载体,转染Beas-2B和A549细胞,转染48h后用带有嘌呤霉素的培养基筛选,建立LNC CRYBG3表达受到抑制的细胞系;应用实时荧光定量PCR检测LNC CRYBG3表达量的变化,得到的细胞系用来进行下一步的实验研究。设计并构建Bub3 shRNA慢病毒载体,转染Beas-2B细胞,转染48h后用带有嘌呤霉素的培养基筛选,使该细胞中Bub3处于稳定的低表达状态。随后运用Western Blot来验证Bub3的蛋白表达水平,得到的细胞系用作进行下一步的实验研究。（2）采用TCGA数据库获取Bub3在非小细胞肺癌中表达量的变化,Bub3表达量和非小细胞肺癌患者临床生存率的关系,以及Bub3的表达量随着肺癌分期的变化,并分析Bub3和LNC CRYBG3是否存在相关关系。提取临床肿瘤样本,以及癌旁组织的基因组,采用实时荧光定量PCR来分析样本中LNC CRYBG3和Bub3表达量的变化,并与TCGA数据库得到的数据进行对比。同时,利用数据库分析CDC20、Bub1和APC/C等纺锤体组装检查点组成部分的表达量与非小细胞肺癌患者临床生存率的关系。（3）细胞体外实验中,在LNC CRYBG3过表达和敲低细胞系中,采用克隆形成实验、Transwell实验以及细胞划痕实验,研究LNC CRYBG3对肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。另外利用秋水仙素将人类永生化的肺上皮细胞Beas-2B的细胞周期阻滞到有丝分裂中期（M期）,然后过表达LNC CRYBG3,来观察LNC CRYBG3对于细胞周期阻滞的影响,并采用活细胞工作站来直接观察细胞有丝分裂的过程。染色核型分析验证LNC CRYBG3对于人类永生化的非上皮细胞Beas-2B细胞系中非整倍体发生情况的影响。在动物实验中,采用尾静脉注射带荧光素酶标签的A549细胞来分析LNC CRYBG3对于非小细胞肺癌细胞体内转移能力的影响。采用PET-CT、病理分析等方法进行分析LNC CRYBG3对于乌拉坦致小鼠肺肿瘤模型成瘤率和成瘤时间的影响。此外,在小气道上皮细胞HSAEC1-KT细胞系中建立LNC CRYBG3、Bub3过表达和敲低细胞系,采用小鼠腹部皮下注射观察LNCCRYBG3和Bub3的表达量对于小鼠皮下移植瘤的影响。在人体实验中,采用2.5 Gy的X射线辐照人外周血,采用实时荧光定量PCR检测LNC CRYBG3的表达量,采用核型分析检测人外周血中非整倍体的发生。（4）采用RNA蛋白质体外结合实验（RNA pull-down）、蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）、RNA免疫共沉淀（RIP）和免疫荧光共定位实验来验证LNC CRYBG3与Bub3的相互作用关系,以及LNC CRYBG3对于Bub3、CDC20、Bub1和APC/C等纺锤体组装检查点组成成分之间相互作用的影响。结果:（1）LNC CRYBG3对小鼠原位肺腺癌的发生具有促进作用。首先,我们使用乌拉坦致小鼠非小细胞肺癌原位模型,测试了 LNC CRYBG3对小鼠非小细胞肺癌发病率的影响。同时接受乌拉坦和LNC-CRYBG3腺病毒尾静脉注射的9只小鼠在注射后76天内全部死亡,而其他三组（对照组、乌拉坦组和乌拉坦+RNA阴性对照组）的小鼠在注射后100天内均未发生死亡。第70天PET-CT检查结果表明,乌拉坦和LNC-CRYBG3注射组的肺组织中18F同位素的吸收量明显高于其他三组。表示这组小鼠的肺部肿瘤结节较多,体积较大。小鼠解剖后发现,只在乌拉坦和LNC CRYBG3联合处理组的肺组织中发现肿瘤结节,后经临床病理检查证实为肺腺癌（肺腺癌特异性的标志物CK7/TTF-1高表达）。此外,这些肿瘤组织中与细胞增殖有关的标志物Ki-67的表达量比其他任何处理组都要高。在LNC-CRYBG3单独高表达组中,与肿瘤样结节相对应的肺区域有高水平的18F摄取;然而,病理检查证实这些结节不是肿瘤。这些结果表明,LNC CRYBG3促进了乌拉坦诱导的小鼠原发性肺肿瘤的形成。但LNC-CRYBG3单独处理在短时间内无法诱导肺腺癌的形成。（2）LNC-CRYBG3促进非小细胞肺癌的增殖和体内外的转移。为了验证LNC CRYBG3的表达量对非小细胞肺癌转移的影响。我们首先建立了 LNC CRYBG3高表达或敲低的肺癌A549细胞系。结果显示,与对照组相比,LNC CRYBG3表达下调的A549细胞增殖明显降低,而LNC CRYBG3表达上调则促进了 A549细胞增殖。集落形成实验结果同样显示,LNC CRYBG3对非小细胞肺癌的增殖有明显的促进作用。Transwell实验结果显示,LNC CRYBG3的过表达可以促进细胞在体外的迁移。为了验证LNC CRYBG3在体内对细胞转移的影响,将转染LNC CRYBG3和空白对照载体的A549细胞分别经尾静脉注入10只裸鼠。注射四周以后,用IVIS-Spectrum-CT检测肺表面转移性结节。结果显示,过表达LNC CRYBG3后,A549细胞在肺中的转移率显著增加。这些结果表明LNC CRYBG3能够促进肺癌细胞在体内外的转移。（3）LNC CRYBG3靶向Bub3促进肿瘤的发生和转移。通过质谱实验,我们发现和对照组相比,过表达LNC CRYBG3后有1501个蛋白的表达量发生变化[fold change＞2;P＜0.05];其中,有1075个表达量上调,而426个表达量下调。KEGG pathway分析结果显示,过表达LNC CRYBG3后,有很多信号通路发生了变化,其中和代谢有关的信号通路变化最大,这与我们之前的研究结果是一致。变化最为显著的前20个信号通路与肿瘤发生、细胞周期调控等存在高度相关性。23个蛋白对细胞周期存在正调控,同时有14个蛋白成负调控。其中,CDC20、BubR1和Bub3是有丝分裂检查点复合体的重要组成部分,能够通过与APC/C直接结合来抑制底物识别和降解。通过TCGA数据分析我们发现,非小细胞肺癌患者的Bub3表达水平明显上调。在215例非小细胞肺癌患者中,Bub3高表达患者总体生存率较低（P=0.0014）。调查显示,TNM分期越高的肿瘤通常对应Bub3的高表达量,因此Bub3表达量与TNM分期存在正相关的关系。此外,Bub3的表达量还与非小细胞肺癌的转移能力有关,Bub3表达量越高,转移能力越强。其余MCC组成成分,CDC20、BubR1等的表达与肿瘤预后无显著相关性。（4）LNC CRYBG3的过表达诱导永生化肺上皮细胞非整倍体的形成。我们用秋水仙碱将Beas-2B细胞同步化到M期,然后过表达LNC CRYBG3,并监测细胞周期分布的变化。在LNC CRYBG3处理组中,细胞能够跨越M期进入G0/G1期,说明LNC CRYBG3能够促进秋水仙碱导致的M期阻滞的细胞向G0/G1期过渡。细胞周期结果显示,LNC CRYBG3组在G2/M期主峰后出现G2/M期亚峰或非整倍体峰。利用荧光标记和活细胞工作站监测,我们进一步证实了 LNC CRYBG3可以诱导的细胞质的不完全分裂。转染LNC CRYBG3的细胞启动有丝分裂,然后发生融合,以错误的染色体数目开始新的细胞周期。这可能是LNC CRYBG3诱导非整倍体发生的主要原因。我们还发现LNC CRYBG3的过表达可以诱导Beas-2B细胞的染色体发生畸变。为了进一步证实这些发现,我们采取了 12名志愿者（22-24岁,男性）外周静脉血,并将全血样本在体外暴露于2.5 Gy的X射线下。核型分析结果显示,与对照组相比,X射线可以诱发外周血淋巴细胞染色体发生改变,非整倍体比例明显高于对照组。qRT-PCR结果显示,与对照组比较,X射线照射后外周血淋巴细胞中的LNC CRYBG3表达量明显升高,具有统计学上的差异。因此,我们推测LNC CRYBG3可能作为癌基因,其过表达通过诱导非整倍体来促进肿瘤的发生。（5）Bub3敲低联合LNC CRYBG3的过表达能够显著促进永生化的肺上皮细胞移植瘤的形成和转移。首先,我们检测了 23例肺癌组织和4例正常人肺组织中LNC CRYBG3和Bub3 mRNA的表达量。结果发现,肿瘤组织中LNC CRYBG3和Bub3 mRNA的表达量均明显高于正常肺组织（P＜0.01）;并且LNC CRYBG3和Bub3 mRNA的表达水平呈正相关。为了进一步证实Bub3参与LNC CRYBG3介导的肿瘤发生发展,我们首先在人肺小气道上皮细胞（HSAEC1-KT）中建立Bub3稳定敲低细胞系,然后过表达LNC CRYBG3腺病毒。随后将这些细胞接种到NOD/SCID小鼠皮下。接种30天后,Bub3敲低联合LNC CRYBG3过表达组和LNC CRYBG3单独过表达组的肿瘤均明显大于对照组,Bub3敲低联合LNC CRYBG3过表达组的肿瘤均大于LNC CRYBG3治疗组。LNC CRYBG3高表达能够明显促进肿瘤在体内的转移。此外,我们还发现LNC CRYBG3的过表达能够促进Bub3蛋白表达水平的升高。这些结果表明,LNC CRYBG3的高表达与Bub3基因敲低共同促进非小细胞肺癌的进展。（6）LNC CRYBG3与Bub3相互作用来抑制有丝分裂检查点复合体各主要组成部分之间的相互作用。RNA蛋白质体外结合实验和RNA免疫沉淀实验,发现Bub3与LNC CRYBG3之间存在直接的相互作用。蛋白质的免疫共沉淀结果显示,LNC CRYBG3的过表达能抑制APC、CDC20与Bub3之间的相互作用,但无法影响APC与CDC20之间的相互作用。基于对LNC CRYBG3二级结构的预测,我们合成了三个截短的LNC CRYBG3片段。实验结果显示,261-317（S3）的核苷酸序列对Bub3和CDC20之间的相互作用具有类似的抑制作用,这意味着该截短体对于LNC CRYBG3与Bub3的结合发挥了主要的作用。同时,我们还检测了LNC CRYBG3对MCC其他组分之间相互作用的影响。结果显示,LNC CRYBG3对它们之间的相互作用影响不大。最后我们应用免疫荧光共定位进一步证实,LNC CRYBG3过表达会减少Bub3与CDC20共定位。相反,在LNC CRYBG3过度表达后,Bub3和CENP-A的共定位增加。我们还利用上述LNC CRYBG3的三个截短体进行实验,进一步确定了只有S3片段（261-371核苷酸）在Bub3和CDC20的共定位中具有抑制作用,并增加了 Bub3和CENP-A的共定位。这些结果表明,LNC CRYBG3通过干扰Bub3和CDC20的相互作用干扰纺锤体组装检查点。因此,一旦LNC CRYBG3过表达,无论有丝分裂过程中是否存在错误,Bub3都会从有丝分裂检查点复合体释放,从而导致非整倍体。结论:在本论文中,我们发现了第一个能够直接与Bub3结合的长链非编码RNA,LNC CRYBG3,它干扰Bub3与CDC20之间的相互作用,进而导致有丝分裂检查点复合体的功能发生紊乱,最终导致细胞内非整倍体的发生。因此,LNC CRYBG3作为一种新的癌基因发挥作用,其高表达促进了非小细胞肺癌的发生、进展和转移。我们的实验结果很好地解释了 LNC CRYBG3在非小细胞肺癌的发生和发展中的重要调控作用,为非小细胞肺癌的诊断、治疗和预后提供了潜在的靶点。