论文部分内容阅读
第一部分:急性胰腺炎胰岛β细胞损伤及人胰腺Krt5+细胞的激活与分化【目的】观察人急性坏死性胰腺炎（ANP）胰腺内、外分泌结构病理改变,及胰腺Krt5+细胞在ANP胰腺中的激活与分化情况。【方法】使用ANP人胰腺标本（N=6）与相对正常人胰腺标本（CON,N=6）,H＆E染色及电镜观察胰腺病理损伤及β细胞超微结构改变;免疫荧光染色标记腺泡细胞及胰岛β细胞;TUNEL染色及Cleaved caspase-3免疫组化染色检测腺泡细胞及β细胞凋亡情况。应用免疫荧光染色及Western blot检测胰腺中Krt5表达,并分析胰腺病理损伤与Krt5+细胞激活的相关性;免疫组化染色及Western blot检测胰腺组织中Rbpj及Hes1表达,并采用连续切片免疫组化染色标记Krt5+细胞中Hes1表达情况。免疫荧光双标染色检测ANP胰腺中Krt5+细胞向β细胞的分化情况。【结果】与对照组胰腺相比,ANP组胰腺组织损伤严重,大量腺泡细胞坏死,间质炎性细胞浸润,部分胰岛呈现坏死特征。相较于对照组,ANP胰腺中AMY+区域与Insulin+区域显著减少（p＜0.05）。电镜观察ANP胰腺部分β细胞出现胞膜断裂,胞质弥散,胰岛素分泌颗粒减少等细胞死亡特征。ANP胰腺外分泌部细胞凋亡较对照组显著增加（p＜0.05）,而两组胰岛内细胞凋亡无统计学差异（p＞0.05）。ANP胰腺Krt5+细胞较对照组显著增加（p＜0.05）,且呈Krt5+导管样或团状结构。Pearson相关性分析提示,Krt5+面积与胰腺损伤评分呈正相关。免疫组化和Western blot结果显示,ANP胰腺中Notch活性较对照组显著升高（p＜0.05）,且Krt5+结构高表达Hes1。免疫荧光双标染色结果显示,ANP胰腺中极少见Krt5+Insulin+细胞。【结论】急性胰腺炎（AP）后胰岛β细胞坏死可能是AP后糖耐量受损及糖尿病（DM）的重要原因之一。ANP人胰腺组织中大量Krt5+细胞激活,伴Notch活性持续升高,极少见胰腺Krt5+细胞向β细胞分化。第二部分:小鼠急性胰腺炎模型中抑制Notch活性促进胰腺Krt5+细胞分化为功能性胰岛β细胞【目的】建立小鼠AP模型,探讨抑制Notch活性是否促使胰腺Krt5+细胞向β细胞分化及改善AP后糖耐量受损。【方法】将FVB/N小鼠随机分为3组,即对照组（CON组）、AP组和AP+DAPT组。每组再分为4个亚组,即1d、3d、7d、15d亚组。采用蛙皮素诱导建立小鼠AP模型,DAPT组采用腹腔注射DAPT（50 mg/kg）抑制小鼠Notch信号通路。H＆E染色观察小鼠胰腺组织病理改变;免疫荧光染色标记AMY及Insulin,观察小鼠内、外分泌细胞损伤;TUNEL染色及免疫组化检测小鼠腺泡及β细胞凋亡。免疫组化染色及Western blot检测各组小鼠胰腺组织Notch活性。检测各组小鼠空腹血糖及糖耐量。免疫荧光染色标记Krt5,Hes1,Insulin,Glut2,评估小鼠AP后胰腺Krt5+细胞的激活与分化情况。【结果】H＆E染色显示,与对照组相比,AP1d组小鼠胰腺大量腺泡细胞坏死,间质炎性细胞浸润,部分胰岛细胞呈现坏死特征;AP7d时胰腺腺泡结构逐渐恢复,而损伤胰岛仍可见细胞坏死现象。相较于对照组,AP组小鼠胰腺外分泌部细胞凋亡显著增加（p＜0.05）,而胰岛内细胞凋亡与对照组无显著差异。AP后小鼠胰腺内Notch通路活性显著升高;与AP组相比,对应时间点的AP+DAPT组小鼠胰腺Notch活性显著降低（p＜0.05）。与对照组相比,AP7d组、AP15d组小鼠出现糖耐量受损,而对应时间点的AP7d+DAPT组、AP15d+DAPT组小鼠糖耐量受损显著改善。AP后小鼠胰腺组织Krt5+细胞大量激活,且Krt5+细胞的Notch活性显著升高;自然病程下极少Krt5+细胞向β细胞分化。与AP组小鼠相比,对应时间点的AP+DAPT组胰腺Krt5+细胞向β细胞分化增加,新生小胰岛数量显著增加（p＜0.05）,且新生小胰岛具有β细胞功能。【结论】小鼠AP模型中部分胰岛β细胞坏死为AP后糖耐量受损的重要原因。AP后小鼠胰腺内大量Krt5+细胞激活伴Notch活性增高,抑制Notch活性促进胰腺Krt5+细胞向β细胞分化,改善AP后糖耐量。第三部分:体外实验验证胰腺Krt5+细胞向β细胞分化机制【目的】分离提取小鼠胰腺Krt5+细胞及鉴定,体外验证抑制Notch活性促使Krt5+细胞分化为β细胞。【方法】蛙皮素诱导建立小鼠AP模型,分别从AP小鼠及对照（CON）小鼠胰腺提取原代细胞。光镜下观察Krt5+细胞形态及免疫荧光染进行鉴定。Western blot检测CON小鼠及AP小鼠原代细胞的Notch活性水平。在AP小鼠分离的Krt5+细胞中加入浓度梯度的DAPT干预,Western blot检测细胞Rbpj及Hes1蛋白水平;免疫荧光标记Krt5与Insulin,评估Krt5+细胞向β细胞分化情况;ELISA检测细胞培养上清的胰岛素水平。【结果】光镜下观察,从CON小鼠胰腺组织中分离出的原代细胞以成团簇状的腺泡细胞为主;而从AP小鼠胰腺中分离出的原代细胞则以单个细胞为主,腺泡细胞团少见。免疫荧光染色结果显示,AP小鼠胰腺分离的原代细胞中有较多Krt5+细胞。Western blot结果显示,与CON小鼠比较,从AP小鼠胰腺分离的原代细胞Notch活性显著升高（p＜0.05）。AP小鼠胰腺Krt5+细胞加DAPT干预后,抑制了Notch活性,促使Krt5+细胞向β细胞分化显著增加（p＜0.05）。【结论】AP小鼠胰腺原代细胞提取后可见较多Krt5+细胞,体外抑制Notch活性可促进胰腺Krt5+细胞向β细胞分化。