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超氧化物歧化酶是体内自由基主要清除剂之一,简称为SOD。现已证明树莓是富含SOD的水果资源。本文以树莓为原料,通过盐析、凝胶层析、离子交换和金属螯合亲和层析等步骤对树莓SOD进行纯化,并对其部分性质进行研究。这些为树莓SOD的进一步深入研究及其在药品、保健食品和化妆品的应用中打下了一定基础。
首先对抽提缓冲液的pH值、抽提体积和抽提次数进行优化,得出最佳的抽提条件:pH值为7.8,抽提体积为三倍,抽提次数为两次。同时通过(NH4)2SO4盐析沉淀实现分级分离,考察了不同饱和度(NH4)2SO4沉淀的酶活力,得出(NH4)2SO4饱和度为50~90%时,能够达到最大酶活。
然后利用凝胶层析初步纯化树莓SOD。纯化条件:柱体1.6×60cm;磷酸盐缓冲液pH7.8、2.5mmol/L;流速0.3ml/min;每管收集3ml。经过SephadexG-100层析分离纯化得到三种SOD同工酶。
分别通过DEAE-52层析和金属螯合亲和层析进一步对树莓SOD纯化,并比较两者纯化效果。DEAE-52层析纯化条件:柱体2.6×60cm;梯度洗脱液pH7.8、2.5mmol/1(250ml)~200mmol/1(250ml)磷酸盐缓冲液;流速0.7ml/min;每管收集3.5ml。金属螯合亲和层析纯化条件:柱体1.0×40cm;离子载体0.1mol/LCuSO4;柠檬酸缓冲液pH5.0、0.1mol/L;流速0.5ml/min;每管收集5ml。通过比较得出,金属螯合亲和层析纯化得到SOD的回收率和纯化倍数均高于DEAE-52层析,因此金属螯合亲和层析更有利于SOD的进一步纯化。
再利用SOD活性染色和SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定和亚基分子量测定。三种SOD均达到电泳纯;三种SOD的亚基分子量分别为:SODⅠ为24000D,SODⅡ为22000D,SODⅢ为18000D。
最后对树莓SOD的理化性质进行研究,即SOD敏感性实验,最大紫外吸收峰和温度、pH值、离子强度及金属离子等因素对SOD的影响。三种酶均对KCN和H2O2不敏感,说明这三种酶都属于Mn-SOD;其最大紫外吸收峰均为280nm;温度对其影响相对稳定,SODⅢ受温度的影响稍大些,而SODⅠ和SODⅡ受温度的影响较小;在pH7~9范围内SOD相对酶活力较高,pH过高或过低SOD均易失活;三种SOD受离子强度的影响较小;三种SOD受金属离子的影响没有很大的差异,Al3+、Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+都具有一定程度的激活作用,而Pb2+、Fe3+、Sn2+则具有非常明显的抑制作用。