论文部分内容阅读
背景神经酰胺作为复杂鞘脂的前体,具有调节细胞内信号通路的作用,参与细胞的生长、增殖、运动、粘附、分化、衰老和凋亡。神经酰胺的形成通过三种不同的途径发生:从头合成途径、鞘磷脂酶途径和补救途径,其在体内的平衡紊乱可能导致神经退行性疾病的发生发展。阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病,临床表现为缓慢进展的认知功能全面衰退并伴有精神异常和人格障碍,其病理特征是细胞外淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)和细胞内过度磷酸化tau蛋白沉积,淀粉样前体蛋白(amyloi dprecursorprotein,APP)在β-分泌酶、γ-分泌酶的作用下异常裂解释放Aβ40和Aβ42,其中Aβ42最具有神经元毒性,其在细胞外沉积形成老年炎性斑导致神经元的死亡。有研究发现神经酰胺能够通过影响Aβ的生成,从而参与AD的发生发展。在AD患者中,神经酰胺水平的提高可以通过稳定APP生成过程中的关键酶-分泌酶-1(beta-Secretase 1,BACE1),从而直接增加Aβ的产生,而生成的Aβ低聚物反过来又通过激活鞘磷脂酶诱导神经酰胺水平的进一步增加,从而形成一个恶性循环,不断促进AD的发生发展。另外,神经酰胺可能通过增加氧化应激影响AD的疾病进展。神经酰胺以浓度依赖的方式刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,ROS导致细胞大分子物质,包括蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸结构功能的改变,从而导致细胞死亡,而神经细胞的高耗氧率、有限的抗氧化防御及低修复活性导致其更容易受到氧化损伤。Parthanatos,是一种多聚 ADP-核糖聚合酶 1(Poly(ADP-Ribose)Polymerase 1,PARP-1)依赖性的细胞死亡。有研究发现神经酰胺介导SH-SY5Y细胞和视网膜神经元中PARP-1过度激活、多聚腺苷酸二磷酸核糖[Poly(ADP-ribose),PAR]聚集和细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)发生核转位,从而导致DNA大片段化和染色质聚集,最终导致细胞死亡,这些已被确定为Parthanatos的共同特征。但AIF没有核酸内切酶活性,不能剪切DNA,推测有其他分子参与其中。Kam TI等发现在脑缺血-再灌注损伤中Parthanatos参与神经元死亡,且巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory,MIF)与AIF共同核转位,发挥核酸内切酶活性,介导DNA大片段化,诱导细胞死亡,因此,MIF可能为Parthanatos的终末分子,进一步明确其在细胞死亡中的作用十分必要。本研究旨在探讨神经酰胺诱导神经元Parthanatos的机制以及MIF在其中的作用。目的探讨神经酰胺是否诱导神经元发生Parthanatos以及相关的分子机制,明确MIF在神经酰胺介导神经元发生Parthanatos中的作用。从而为AD发生发展和治疗提供新思路及可能的治疗靶点。方法通过分离和培养胎鼠(孕17-19天C57BL6J小鼠)原代皮层及海马神经元,采用CCK-8试验检测细胞活力、Hoechst33342/PI双染试验检测细胞死亡、彗星试验检测DNA损伤、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测PAR聚合物表达水平、AIF和MIF核转位及DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平,细胞免疫荧光试验进一步验证AIF和MIF的核转位;通过慢病毒转染干扰原代神经元中MIF、AIF 基因表达,实时荧光定量 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及Western blot验证其转染效率,采用细胞免疫荧光技术进一步验证MIF在神经酰胺介导神经元Parthanatos中的作用;采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针检测细胞内 ROS水平,验证ROS在神经酰胺诱导神经细胞死亡过程中的作用。结果1、CCK-8及Hoechst33342/PI双染结果显示,与对照组相比,神经酰胺处理组神经元活力显著降低,细胞死亡明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与神经酰胺处理组相比,PARP-1抑制剂ABT888+神经酰胺组中神经元活力明显增加,细胞死亡显著降低,具有统计学差异(P<0.05);而泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK+神经酰胺处理组中神经元活力和细胞死亡与神经酰胺处理组相比无统计学差异。2、彗星试验及Western blot结果显示,与对照组相比,神经酰胺处理组拖尾现象明显,尾部DNA含量显著增加,DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、Western blot结果显示,神经酰胺浓度增加与PAR聚合物表达水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot及免疫荧光试验结果显示,与对照组相比,神经酰胺处理组AIF、MIF在细胞核内表达水平明显增加,具有统计学差异(P<0.05),AIF、MIF在细胞核内存在共定位现象,证明神经酰胺诱导神经元Parthanatos。4、分别用携带沉默AIF、MIF基因质粒的慢病毒转染干扰AIF、MIF的表达;Western blot、彗星试验和Hoechst/PI双染试验结果显示,与神经酰胺处理组相比,MIF KD+神经酰胺组细胞死亡明显减少,彗星尾部长度和尾部DNA含量明显降低,γ-H2AX表达水平显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5、免疫荧光试验结果显示,与神经酰胺处理组相比,AIF KD组MIF核转位显著减少,而MIF KD组AIF核转位无明显差异,表明MIF是AIF的下游。6、DCFH-DA荧光探针结果显示,神经酰胺显著增加神经元内ROS水平,与对照组相比,具有统计学差异(P<0.05)。Western blot、彗星试验和Hoechst/PI双染试验结果显示,与神经酰胺处理组相比,ROS抑制剂NAC预处理+神经酰胺处理组中γH2AX和RAR水平显著下降、彗星尾部长度和尾部DNA含量明显降低、神经元死亡明显减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.神经酰胺激活PARP-1,诱导PAR多聚体形成,导致DNA损伤和细胞死亡。2.神经酰胺诱导AIF与MIF相互作用,共同核转位,MIF发挥核酸内切酶功能,剪切DNA导致神经元发生Parthanatos。3.神经酰胺通过ROS/PARP-1/PAR/AIF/MIF途径诱导神经元发生Parthanatos。